Survivin基因启动子区-31C/G多态性与散发性结直肠癌遗传易感性的关系

　　作者：黄俊1,汪建平1,王,磊1,刘焕亮　　作者单位：中山大学 1. 附属第六医院结直肠外科， 2. 胃肠病研究所， 广东 广州 510655

　　【摘要】【目的】 探讨生存素Survivin基因启动子区-31C/G单核苷酸多态性与中国华南地区散发性结直肠癌(CRC)遗传易感性的关系。 【方法】 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)检测华南地区711例健康人和702例CRC的Survivin基因-31C/G位点单核苷酸多态性。【结果】 结直肠癌患者CC基因型的频率明显高于对照人群(36.35% vs. 26.2 %， χ2 = 17.89， P < 0.001)，与CC基因型相比，CG、GG基因型和等位基因G携带者的CRC发病风险分别显著下降至0.61倍(95% CI = 0.46 ～ 0.80， P < 0.001)、0.52倍(95% CI = 0.38 ～ 0.71， P < 0.001)和0.58倍(95% CI = 0.45 ～ 0.74， P < 0.001)。【结论】 Survivin基因-31C/G多态性与CRC发病风险有关，-31G变异基因型是中国南方人群散发性结直肠癌独立保护因素。

　　【关键词】 结直肠癌,Survivin基因,单核苷酸多态性

　　Abstract： 【Objective】 To investigate the association between -31C/G polymorphism in the promoter of survivin gene and the susceptibility to sporadic colorectal cancer in southern Chinese population. 【Methods】 Survivin-31C/G genotypes were determined by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) in 711 healthy controls and 702 CRC cases. 【Results】 The number of CRC patients carrying with CC genotype was much higher than those of controls (36.5 % vs. 26.12%， χ2 =17.89， P < 0.001). Compared with CC genotypes， CG， GG genotypes and G allele carriers had a significantly decreased risk of CRC， with the decrease being 0.61-fold (95% CI = 0.46-0.81， P < 0.001)， 0.52-fold (95% CI = 0.38-0.71， P < 0.001) and 0.58-fold (95% CI = 0.45-0.74， P < 0.001)， respectively. 【Conclusion】 Survivin gene -31C/G polymorphism is associated with sporadic CRC risk， the G variant genotype is the independent protective factors against sporadic CRC in southern Chinese population.

　　Key words： colorectal cancer; survivin gene; single nucleotide polymorphism

　　[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci)，2010，31(1)：59-63]

　　结直肠癌(colorectal cancer， CRC)是最常见的消化道恶性肿瘤之一，近年来，随着食物结构和生活方式的改变，我国的结直肠癌发病率和死亡率呈逐年上升趋势。结直肠癌的形成和发展是一个多步骤、多阶段及多基因改变的过程，随着其发病机制研究的深入， 细胞增殖和凋亡的失衡在结直肠癌发生发展中的作用日益受到关注。Survivin是近年发现的凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis protein， IAP)的新成员，具有抑制细胞凋亡和调节细胞增殖的双重功能[1]。目前认为Survivin在抑制细胞凋亡、调节细胞周期、促进细胞增殖及细胞转化等方面均发挥着重要作用从而促进了结直肠癌的细胞周期、促进细胞增殖及细胞转化等方面均发挥着重要作用从而促进了结直肠癌的发生发展[2]。最近发现Survivin基因启动子区-31C/G多态(起始密码子第一个核苷酸为 + 1)能下调Survivin的表达，进而影响肿瘤遗传易感性[3]。到目前为止，尚无关于Survivin-31C/G多态性与中国人群CRC发病风险的相关性的研究报道。因此我们在多中心大样本基础上探讨Survivin-31C/G多态性与我国华南地区汉族人群结直肠癌发病风险的关系，这将有助于筛选CRC的高危人群，评估个体罹患CRC的风险，实现疾病的早期预防、早期控制和早期治疗。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象

　　病例组选自2002年7月至2008年12月间在中山大学附属第六医院(中山大学附属胃肠肛门医院)、中山大学附属肿瘤医院、中山大学附属第一医院、广州医学院附属肿瘤医院、广东省人民医院和广州市番禺区人民医院就诊的702例结直肠癌患者，均经组织病理确诊，病例组对象纳入标准包括：广州及周边地区汉族;无血缘关系。剔除标准为家族性腺瘤性息肉病和遗传性非息肉性结直肠癌。对照组为同时期同一地区无血缘关系的健康体检人员，均为汉族，共711例，对照组与病例组按年龄(± 5 岁) 和性别上相匹配。

　　1.2 Survivin基因-31C/G基因型鉴定

　　按常规蛋白酶K消化、苯酚/氯仿抽提、乙醇沉淀法(所用DNA提取试剂盒为Qiagen， Valencia，CA)提取外周血白细胞基因组DNA，pH8.0 TE溶解，-20 ℃保存。Survivin-31C/G(refSNP ID：rs9904341)多态采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism， PCR-RFLP)进行基因分型。扩增包含-31C/G位点在内的151 bp片段，上游引物序列为5′-AAG AGG GCG TGC GCT CCC GAC A-3′，下游引物序列为5′-GAG ATG CGG TGG TCC TTG AGA AA-3′(上海Invitrogen公司合成)。12-?滋L PCR 反应体系中含：2 × GoTaq MasterMixs(Promega) 6 ?滋L，1 ?滋L(100 ng/?滋L)基因组DNA，上、下游引物(5 μmol/L)各1 ?滋L，3 ?滋L 双蒸水。PCR反应的条件为：94 ℃预变性 5 min，然后94 ℃变性30 s，62 ℃退火45 s，72 ℃延伸15 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。

　　PCR扩增产物与限制性内切酶MspI(New England BioLabs)于37 ℃水浴过夜酶切， 酶切产物以含有溴化乙锭的20 g/L 琼脂糖凝胶电泳分离。CC 基因型产生61、90 bp两个片段， GG 基因型只有1个151 bp片段， 而杂合子CG则为151、61、90 bp 3个片段(图1)。

　　结果由两位不知道病例或对照组的试验者判断。对于每个位点，随机抽取10%样本重复试验并测序验证，结果100%一致。

　　1.3 统计分析

　　以拟合优度χ2检验进行哈迪-温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium， HWE)检验;以χ2检验明确分类变量(如基因分型)在病例和对照组间的分布差异;通过拟合非条件logistic回归模型明确研究因素与CRC易感性的关系，以校正优势比(adjusted odds ratio，OR)及其95%可信区间(95% confidence interval，95% CI)表示患病风险。所有的统计检验均为双侧概率检验，以P < 0.05为统计学显著性界限， 数据采用SPSS 13.0处理。

　　2 结 果

　　2.1 研究对象的一般情况

　　CRC病例组与对照组比较，年龄、性别分布差异无统计学意义(P值分别为0.973，0.938)。现在吸烟者、现在饮酒者、高体质量指数者及有癌症家族史者在病例组的分布频率远高于对照组(P<0.05;表1)。

　　2.2 Survivin基因多态性分布与结直肠癌风险

　　对照组基因型分布频率符合哈迪-温伯格遗传平衡(χ2 = 0.62， P = 0.43)，结直癌患者-31C等位基因及CC基因型频率显著高于对照组(58.0% vs. 50.4 %， χ2 = 16.24，P < 0.001;36.5% vs. 26.2%，χ2 = 17.89， P < 0.001)，logistic多因素回归分析显示与CC基因型相比，CG、GG基因型和等位基因G携带者(即CG + GG基因型)的CRC发病风险分别显著下降至0.61倍(95% CI = 0.46 ～ 0.80，P < 0.001)、0.52倍(95% CI = 0.38 ～ 0.71，P < 0.001)和0.58倍(95% CI = 0.45 ～ 0.74，P < 0.001;表2)。

　　2.3 Survivin基因多态性与中国南方散发性结直肠癌相关性分层分析

　　我们进一步按年龄、性别、吸烟、饮酒、癌症家族史和体质量指数分成亚组，在各亚组中分层分析Survivin启动子基因型和散发性结直肠癌的关系。含有-31G变异基因型(即CG + GG)降低散发性结直肠癌患病风险的效应在年轻(≤60岁)(adjusted OR = 0.54，95% CI = 0.38 ～ 0.78，P = 0.001)，体质量指数 < 23.9 kg/m2者(adjusted OR = 0.54，95% CI = 0.40 ～ 0.75，P < 0.001)中更为明显。另外，在年龄、性别、吸烟及饮酒各亚组中，-31G变异基因型和散发性结直肠癌风险降低都明显相关。但是，在有一级或二级亲属癌症家族史者(P = 0.256)和体质量指数 ≥ 28.0 kg/m2者(P = 0.680)中，-31G变异基因型的保护作用并无统计学意义(表3)。

　　3 讨 论

　　结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其发生和发展机制尚未完全阐明。目前研究发现，细胞凋亡的抑制使一些突变或转化细胞逃避机体免疫系统的监视而异常存活、累积形成优势克隆在结直肠癌的发生和发展中可能有重要的地位[4]。Survivin是新近发现的一种凋亡抑制基因，其编码产生含142个氨基酸的蛋白。与凋亡抑制蛋白家族的其它成员相比，Survivin蛋白结构非常独特，N端仅含有一个杆状病毒IAP重复序列(baculovirus IAP repeat， BIR)结构域，在C端缺少锌指结构而代之为α-螺旋结构[5]。Caspase级联激活并溶解蛋白质是细胞凋亡的核心机制，Survivin蛋白通过干扰内源性凋亡信号通路上游启动因子caspase-9的活化及直接抑制内/外源凋亡信号通路下游共同的终未效应因子caspase-3、caspase-7而实现其抗凋亡作用[6]。

　　3.1 Survivin-31G变异基因型是中国南方人群散发性结直肠癌的独立保护因素

　　许多研究证实Survivin在人类绝大多数恶性肿瘤组织，包括结肠癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌和乳腺癌等表达明显上调，并与预后差、肿瘤进展及药物耐受相关[7]。Survivin基因转录异常是Survivin在肿瘤组织中异常高表达的主要机制，Survivin基因-31C/G多态位于启动子区细胞周期依赖性元件(cell cycle dependent element，CDE)/细胞周期同源区(cell cycle homology region，CHR)，-31G变异等位基因通过改变CDE/CHR调控元件结合位点的特异序列增加阻遏蛋白与CDE/CHR元件结合从而降低Survivin的表达，进而影响肿瘤遗传易感性[3，8]。目前关于Survivin基因-31C/G多态性与肿瘤易感性的研究报道不多而且结果也不尽相同。Wang等[9]的研究认为在台湾人群中膀胱上皮癌患者CC基因型频率显著高于对照组(34.7% vs. 20.9%)，与GG基因型相比，CC基因型明显增加台湾人群膀胱上皮癌的发病风险(校正OR = 4.0， 95% CI = 2.3 ～ 7.2)。一项希腊人群的病例对照研究发现CC基因型可显著增加罹患CRC的风险(校正OR = 2.68，95% CI = 1.77 ～ 4.07)，CC基因型携带者Survivin mRNA水平是CG或GG基因型携带者的1.6倍[10]。与上述研究相似，我们通过多中心大样本的病例对照研究也发现Survivin-31C/G多态与中国人群CRC发病风险明显相关，-31G变异基因型可以明显降低CRC的发病风险(校正OR = 0.58，95% CI = 0.45 ～ 0.74)，是中国南方罹患散发性结直肠癌的独立保护因素，并且随着-31G等位基因增加CRC患病风险更加降低，有等位基因剂量效应，其合理解释是-31G变异等位基因下调survivin表达，增加机体凋亡清除DNA受损变异细胞的能力，从而降低对结直肠癌的遗传易感性。但在胃癌及宫颈癌中Survivin基因-31C/G多态性与肿瘤发病风险无明显相关[11-12]，这可能与不同肿瘤的致癌作用机制不同有关。

　　3.2 Survivin-31C/G多态性与结直肠癌其它危险因素的关系

　　我们分层分析发现在年龄、性别、吸烟及饮酒各亚组中，-31G变异基因型和散发性结直肠癌风险降低都明显相关，但在有一级或二级癌症家族史者和体质量指数≥28.0 kg/m2者中-31G变异基因型与散发性结直肠癌患病风险无明显相关。因此我们认为有癌症家族史和肥胖可能影响-31G变异基因型对结直肠癌的保护作用。这可能与有癌症家族史者的遗传背景有关，而肥胖所引起的胰岛素抵抗、高胰岛素血症及胰岛素样生长因子增高已经被越来越多的研究所证实是诱发结直肠癌的重要环节[13-14]，从而使这部分群体失去了-31G等位基因的保护作用。

　　3.3 结 论

　　本研究表明Survivin-31G变异基因型是中国南方人群罹患散发性结直肠癌的独立保护因素，这种保护作用在年龄≤60岁和体质量指数 < 23.9 kg/m2者更为明显，可作为CRC发病风险的筛选指标。就目前我们所检索到的文献来看，这是目前关于中国人群Survivin基因遗传变异与CRC易感性关系的首次报道。当然我们的发现还需要样本量更大的、最好是以人群为基础的病例对照研究去验证，并有待于更深入的分子机制研究去证实。

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