黄芩素对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响及miR-34a在其机制中的作用

　　作者：宋超1,刘霞2,邵启祥2,徐三荣1　　作者单位：1.江苏大学附属医院普外科， 江苏 镇江 212001; 2.江苏大学基础医学与医学技术学院， 江苏 镇江 212013

　　【摘要】目的：观察12-脂氧合酶抑制剂黄芩素(Baicalein)对人肝癌细胞株HepG2增殖和凋亡的影响，并初步研究miR-34a在黄芩素影响HepG2细胞机制中的作用。方法：黄芩素(浓度分别为25、50和100 μmol/L)作用HepG2细胞24 h和48 h后，分别用Hoechst33342染色后荧光显微镜观察HepG2细胞形态变化，CCK8法检测细胞增殖活性，流式细胞术检测细胞凋亡的情况。采用qRT-PCR检测HepG2细胞中miR-34a的表达。结果：黄芩素(浓度分别为25、50、100 μmol/L)作用24、48 h后，HepG2细胞数量明显减少，细胞核固缩或裂解;CCK8法显示细胞增殖受到抑制;流式细胞术检测显示DNA染色荧光强度下降，黄芩素作用24 h后细胞出现DNA亚二倍体峰的比率分别为16.10%、33.18%和68.34%,48 h后为19.55%、36.59%和74.08%，活细胞比率下降，细胞死亡率增加。黄芩素处理后的HepG2细胞中miR-34a的表达量较未处理组明显增高。结论：黄芩素能抑制HepG2细胞的增殖，促进其凋亡，其机制可能与miR-34a上调有关。

　　【关键词】 脂氧合酶抑制剂,黄芩素,HepG2细胞; 细胞凋亡; miR-34a

　　[Abstract]　Objective： To investigate the effects of 12-lipoxygenase inhibitor Baicalein on human hepatocellular carcinoma cell line HepG2， and the role of miR-34a in the mechanism of Baicalein effect on HepG2 cells. Methods： HepG2 cells were treated by Baicalein within different concentrations (25， 50， 100 μmol/L ) 24， 48 h respectively. The morphological changes of HepG2 cells were observed under fluorescence microscope after stained with Hoechst33342. Cell proliferation was validated by CCK8. Flow cytometry (FCM) was used to analyse the DNA content of HepG2 cells stained with PI. miR-34a of HepG2 cells was detect by qRT-PCR after treated with or without Baicalein. Results： Obvious appearances of cell apoptosis were observed under fluorescence microscope stained with Hoechst 33342， including chromatin condensation， nuclear fragmentation， and apoptotic bodys forming. The result of CCK8 assay showed that the cell proliferation of HepG2 was inhibited in a dose and time dependent manner. A decrease of fluorescence intensity of DNA of HepG2 cells with PI staining was demonstrated by FCM and accompanied with the presence of the hypodiploid peak. The percentage of cells with hypodiploid DNA content of HepG2 cells， treated with three different concentrations of Baicalein for 24 h， was 16.10%， 33.18% and 68.34% respectively. It was 19.55%， 36.59% and 74.08% respectively after the cells treated with three different concentrations of Baicalein for 48 h. The expression of miR-34a in HepG2 cells was increased after being treated with Baicalein. Conclusion： Baicalein induced cell apoptosis of human hepatoma cell line HepG2 may be via miR-34a.

　　[Key words]　lipoxygenase inhibitor; Baicalein; HepG2 cell; apoptosis; miR-34a

　　黄芩素又称黄芩苷元，或5,6,7-三羟基黄酮(5,6,7-Trihydroxyflavone)，是从唇形科植物黄芩的干燥根分离出的单体，相对分子质量为270.24，分子式为C15H10O5。黄芩素属于黄酮类化合物，具有多种药理作用，临床主要用于抗炎和抗菌[1-2]。目前的研究表明黄芩素还具有抗肿瘤活性[2]。

　　微小RNA(MicroRNA，miRNA)是一类长约19～22个核苷酸的内源性非编码的小分子RNA，通过对靶基因转录后水平的负性调控作用，从而降低靶基因的表达水平[3]。近年研究证实miRNA在肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡等生物学过程中发挥了重要作用[4]。miR-34是p53的直接作用靶标，能与细胞周期蛋白E2、CDK6、BCL-2和E2F等形成复合物，抑制靶基因的翻译或降解靶基因的mRNA，诱导细胞周期停滞在G1期，从而导致细胞凋亡和衰老[5]。

　　肝癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年新增肝癌病例超过100多万[6]。肝癌的化学药物治疗是其手术治疗的必要补充和晚期肝癌的主要治疗手段。但目前的化疗药物大多数细胞毒性很强，而且价格比较昂贵，因此寻找一种高效低毒、价格低廉的药物非常重要。近年来研究发现，脂氧合酶在肿瘤的发生发展过程中有着重要作用[7-8]，其中12-脂氧合酶在肝癌发生发展中的作用逐渐受到重视。本实验主要观察了12-脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)抑制剂——黄芩素对人肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响并探讨其初步机制，为黄芩素治疗肝癌提供实验依据。

　　1　材料与方法

　　1.1　材　料

　　人肝癌HepG2细胞株由江苏大学药学院高静教授惠赠，黄芩素购自四川绵阳东方源生物科技公司(纯度>98%)，丝裂霉素(10 mg/支，浙江海正药业公司生产);DMEM、新生胎牛血清购自杭州四季青公司，DMSO购自Siga-Aldrich公司，CCK8试剂盒和碘化丙锭(PI)购自Sigma公司，RT-PCR试剂盒购自Fermentas公司，PCR仪为BioRad CFX96。

　　1.2　方　法

　　1.2.1　细胞培养

　　HepG2细胞在37℃、5%CO2条件下培养于含10%新生胎牛血清的DMEM培养基中。

　　1.2.2　试剂配制

　　使用DMSO溶解黄芩素，配制成25、50和100 mmol/L的贮存液，使用时按1 ∶1000的比例加入培养液中，终浓度为25、50和100 μmol/L。阴性对照组加入等量的DMSO，阳性对照组加入等量丝裂霉素(20 mg/L)。将碘化丙啶溶于PBS(pH7.4)中，加入1%枸橼酸钠和0.1% Triton X-100，PI终浓度为50 mg/L，用棕色瓶4℃避光保存。

　　1.2.3　荧光显微镜下观察细胞形态

　　在6孔板内放置盖玻片，将HepG2细胞接种于6孔板中，当细胞生长至汇合度60%左右时，加入浓度分别为25、50和100 μmol/L的黄芩素。另设不加黄芩素的空白对照，阴性对照组(DMSO组)，阳性对照组(丝裂霉素组，加入等量的浓度为20 mg/L 的丝裂霉素)。各组作用24和48 h后，加入新鲜配置1 ∶3混合的冰醋酸/甲醇固定液，干燥;用新鲜Hoechst 33342染料溶液染色30 min，滴加pH 5.5柠檬酸缓冲液封片，使用荧光显微镜进行观察。结果判断标准：正常细胞的胞核清晰可见，形态均一;阳性细胞的胞核稀少、固缩，荧光增强，核裂解可见双核或多核。

　　1.2.4　CCK8比色法检测细胞增殖活性

　　将对数生长期的HepG2细胞制成单细胞悬液，按1×104个细胞/孔接种于96孔培养板，37℃、5%CO2培养过夜，使细胞贴壁。弃上清，加入终浓度为25、50和100 μmol/L 黄芩素溶液，以不含黄芩素的培养细胞为空白对照，以含DMSO的培养细胞为阴性对照，以含丝裂霉素的培养细胞为阳性对照，每组设3个复孔，同时设不含细胞和不做任何处理的培养基三孔消除背景干扰。于培养结束前4 h加入CCK8,10 μl/孔，使总体积为100 μl/孔，用酶标仪检测光密度(检测波长450～490 nm，参比波长600～650 nm)，分析数据。按以下公式计算细胞存活率，然后绘制成图表，细胞存活率为50%的值即为IC50。细胞存活率(%)=[(实验孔D值-空白孔D值)/(对照孔D值-空白孔D值)]×100%。

　　1.2.5　流式细胞仪检测细胞凋亡率

　　将HepG2细胞以浓度为5×105个/L接种于6孔培养板，置于37℃、5% CO2培养箱内培养24 h后，加入终浓度为25、50和 100 μmol/L的黄芩素处理细胞24、48 h。阴性对照组加入等量的DMSO，阳性对照组加入等量丝裂霉素(浓度为20 mg/L)。消化收集细胞，1 000 r/min离心5 min，PBS液洗涤1次，离心去PBS，加入冰预冷的70%的乙醇，4℃，固定2 h。离心弃去固定液，用1 ml 碘化丙碇染液染色，4℃避光30 min,400目的筛网过滤1次，流式细胞仪(BD公司)测细胞DNA荧光强度。

　　1.2.6　RT-PCR

　　1.2.6.1　引物设计与合成

　　所有引物由上海生物工程公司合成，在基因库查找基因序列，根据miRNA的结构特点，首先设计茎环结构(Stem-loop)的逆转录引物，其中包含有44 bp的茎环结构和3′端的6个miRNA-34a碱基序列，然后按照逆转录产物序列设计PCR引物(序列见表1)。表1　本实验所用引物序列和长度

　　1.2.6.2　RT-PCR

　　将提取的总RNA用DEPC水调整浓度至100 ng/μl，取2 ng，加逆转录引物1 μl、DEPC水12 μl混匀，置65℃ 5 min，冰上2 min，然后依次加入5×反应缓冲液4 μl，RNA酶抑制剂(20 U/μl) 1 μl,10 mmol/LdNTP 混合物2 μl，Revert Aid M-MuLV逆转录酶(200 U/μl)1 μl，混匀，PCR仪上经42℃ 1 h,70℃ 5 min，完成逆转录。PCR中每个标本均设立U6对照管与检测管，温度设置为94℃ 2 min,94℃15 s,60℃ 1 min，共30个循环，最后采用40 g/L琼脂糖凝胶电泳观察结果。

　　1.2.6.3　荧光实时定量PCR检测miR-34a的表达

　　逆转录出的cDNA在BioRad CFX96定量PCR仪上进行PCR定量检测。PCR条件为94℃ 2 min,94℃ 15 s,60℃ 1 min，进行40个循环;采用U6 RNA作为内标。样品目的基因的相对表达率(relative expression，RQ)采用△△CT方法计算，RQ= 2-△△CT，以未处理的HepG2细胞作为相对表达的标准。

　　1.3　统计分析

　　所有实验重复3次，数据结果以x±s 表示，使用SPSS10.0统计软件，完全随机分组实验所得数据的多组比较采用方差分析，成组分析采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2　结　果

　　2.1　荧光显微镜下HepG2细胞形态变化

　　显微镜下，空白对照组与DMSO组的细胞排列紧密，形态规则;丝裂霉素组的细胞数量减少，形态不规则，核断裂，细胞裂解成碎片;黄芩素组随着药物浓度增大和作用时间延长，细胞数量和形态变化明显，细胞数量减少，细胞萎缩，可见核染色质边集，核固缩或断裂，细胞裂解成碎片(图1)。图1　荧光染色法显微镜下肝癌细胞形态的变化(×400)

　　2.2　黄芩素对肝癌HepG2细胞增殖活性的影响

　　CCK8增殖试验结果显示，空白组和DMSO组HepG2细胞增殖明显，黄芩素组细胞增殖受到明显抑制，且随着浓度增加和作用时间延长，HepG2细胞的增殖数目和速度下降，黄芩素各浓度组(25、50和100 μmol/L)与空白和阴性对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。表2　不同浓度黄芩素作用HepG2后细胞存活率

　　2.3　黄芩素对肝癌HepG2细胞凋亡的影响

　　FCM检测显示黄芩素能诱导HepG2细胞死亡，并出现DNA亚G峰，说明黄芩素有可能诱导HepG2细胞凋亡，且呈时间和剂量依赖关系(图2)。图2　流式细胞术检测经不同浓度黄芩素处理24 h和48 h的HepG2细胞DNA含量

　　2.4　miR-34a在肝癌HepG2细胞中的表达

　　普通PCR电泳结果显示，黄芩素处理组和未处理组均有miR-34a和U6的特异性条带(图3)。在qRT-PCR结果中，miR-34a与U6均显示出可靠的Ct值，黄芩素处理组miR-34a的表达明显升高， 是未处理组的5.7倍(表3)。表3　荧光实时定量PCR检测的miR-34a与U6 Ct值图3　常规PCR检测miR-34a和U6

　　3　讨　论

　　肿瘤的发生发展与花生四烯酸的代谢途径密切相关。花生四烯酸的代谢主要有环氧合酶、脂氧合酶和细胞色素P450等途径。近年来，脂氧合酶代谢途径在肝癌发生发展中的作用日益受到重视。其中12-脂氧合酶在正常组织中不表达或者低表达，而在食管癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌和某些细胞系中高表达[7-12]。因此，12-脂氧合酶过度表达可能是诱导某些肿瘤发生发展的原因之一。所以，抑制12-脂氧合酶表达可以起到一定的抗肿瘤作用。有研究发现，12-脂氧合酶有3个亚型：白细胞型、表皮型和血小板型(p12-LOX)。p12-LOX及其代谢产物被认为具有刺激肿瘤细胞生长与增殖、提高肿瘤细胞侵袭能力及诱导肿瘤微血管生成等作用，而这些作用又可被12-脂氧合酶特异性抑制剂黄芩素所抑制[9]。

　　黄芩素属于黄酮类化合物，黄酮类化合物的黄酮结构是由一个γ-吡喃酮环连接两个苯环而成的邻苯二酚，此外还发现吡喃酮环与苯环间扭转角度的二维结构特性是影响其作用的一个重要因素。大量研究证实[13-14]，黄芩素可诱导小鼠膀胱癌MBT-2细胞株、人肾癌细胞株(A-498和RC-1)、人非小细胞肺癌H460细胞、人胃癌AGS和MNK-28细胞系、结肠癌和前列腺癌等肿瘤细胞的凋亡。Leung等[13]研究发现，人非小细胞肺癌H460细胞用黄芩素培养48 h后，多数细胞凋亡，Bcl-2表达减少，而Bax、caspase 3蛋白表达增加。研究人员还发现，黄芩素可破坏人肝癌HepG2细胞胞膜的完整性，导致线粒体膜电位降低，cyt C释放，Bcl-2蛋白表达降低，S期生长停滞，从而诱导肿瘤细胞凋亡[9]。因此对黄芩素等脂氧合酶抑制剂的深入研究，有助于全面认识脂氧合酶抑制剂抗肿瘤作用的机制。

　　本实验中HepG2细胞经不同浓度黄芩素作用24 和48 h后，出现细胞密度降低、核染色质边集、核固缩或断裂等凋亡现象。CCK8检测结果显示，黄芩素能抑制HepG2细胞的增殖，且具有时间和剂量依赖关系。流式细胞术检测结果显示，黄芩素处理的细胞发生死亡，并有亚二倍体峰出现。上述结果说明黄芩素可以诱导HepG2细胞死亡，可能主要以凋亡形式为主。

　　近年来的研究发现，miRNA在肿瘤的增殖、分化和凋亡等生物过程中发挥了重要作用。其中miR-34家族在肿瘤的凋亡中发挥了重要作用，该家族主要包括3个成员：miR-34a，miR-34b和miR-34c。miR-34的主要功能：①诱导细胞凋亡，miR-34的激活能促使caspase 3和PARP裂解，诱发caspase调控的凋亡途径[15];还可以通过抑制Bel-2促进细胞凋亡[16];②阻滞细胞周期：研究发现将miR-34a全长转录体导入骨肉瘤U-2OS细胞48 h后，导入组相对于对照组停滞在G1期的细胞数目增加，同时伴随S期细胞数目的减少，说明miR-34a可使细胞周期阻滞在G1期[17]。同时研究还发现p53是miR-34a发挥作用的始动基因。Chang等[18]研究发现，miR-34a缺失的胰腺癌患者中，p53抗肿瘤的作用将受到影响。Hermeking[19]指出，端粒酶的氧化应激和癌基因的活化等因素导致DNA损伤，激活p53，p53又激活miR-34，miR-34与E2F3、Bcl-2、CDK4、CDK6、细胞周期蛋白E2以及E2F5形成复合物，抑制或降解下游基因的mRNA发挥功能[20]。朱忠超等[21]的研究认为，原发性肝癌中人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)表达上调，hTERT表达端粒酶激活贯穿于原发性肝癌的发生、发展过程，说明癌组织中hTERT参与了肝癌端粒酶活性的调控。因此，我们推测miR-34a在黄芩素诱导的HepG2细胞凋亡中发挥作用。

　　qRT-PCR显示miR-34a在黄芩素处理的HepG2细胞中的表达较未处理的HepG2细胞中升高了5倍之多。因此黄芩素有可能通过上调miR-34a的表达诱导细胞的凋亡，但具体机制尚需要进一步深入研究。

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