不同来源肝干细胞的分选方法

　　作者：吕刚1,卫立辛2,蒲永东1,吴孟超2　　　作者单位：1解放军第309医院(总参谋部总医院)　普通外科　(北京　100091)　2上海东方肝胆外科医院　肿瘤免疫治疗中心　(上海　200438)

　　【摘要】肝干细胞是一类具有干细胞特征并且能向肝细胞和胆管细胞分化的细胞，具有无限的增殖能力及多向分化潜能。肝干细胞可以来源于胚胎发育过程中出现的胎肝干细胞，成年肝内存在的肝干细胞及其子代细胞卵圆细胞、小肝细胞、肝星状细胞以及特定情况下肝外来源的细胞(如骨髓、胰腺、脐血、胎盘)等。近年来如何分离和鉴定这一小群细胞成为研究的热点。由于肝干细胞治疗各种原因引起的肝病具有无可比拟的优势，因此探讨获取肝干细胞的方法有重要的现实意义。本文就近年来对不同来源的肝干细胞的分选方法进展做一综述。

　　【关键词】 干细胞,肝,分选,标志物

　　肝脏是一个具有强大再生能力的器官，但是除了成熟的肝细胞参与了肝脏的再生修复之外，其他细胞是否参与修复过程在很长时间内不为人所知。近些年来有学者通过一系列设计巧妙的实验，证实了肝前体细胞的存在，并且提出了肝干细胞学说[1-2]。从定义上，肝干细胞应当具有干细胞的所有特征，主要体现在无限的增殖能力及多向分化潜能两方面。目前研究认为，体内多种细胞符合肝干细胞的特征，主要有：胚胎发育过程中出现的胎肝干细胞，成年肝内存在的肝干细胞及其子代细胞卵圆细胞、小肝细胞、肝星状细胞，特定情况下肝外来源的细胞(如骨髓、胰腺、脐血、胎盘)等[3]。尽管目前关于肝干细胞的研究如火如荼地展开，但瓶颈问题依然没有解决：如何获得高纯度的肝干细胞?肝干细胞有没有特异性的标志物?本文就近年来对不同来源肝干细胞的分选方法进展做一综述。

　　肝干细胞分离和鉴定主要依赖于细胞的生物学特性和表面的特异性标志物。一般多采用两步胶原酶灌注法结合荧光激活细胞筛选法及免疫磁珠细胞筛选法。后两种方法本质上都是以免疫亲和技术为基础，利用待分离的细胞具有特异性表面标志物的特性，可以被抗体标记后用免疫磁珠颗粒或流式细胞计数等方法分选，并通过对所获细胞进行定向诱导培养后表达肝细胞和胆管细胞的表面标志物(AFP、白蛋白、CK18、CK19)得到证实[4]。

　　1　胚胎肝干细胞的分选

　　有关胚胎肝干细胞(embryonic liver stem cells，ELSC)分选方法的经验多来自于动物。由于ELSC缺乏特异性的细胞表面标志物，其获得一般先采用阴性选择去除造血细胞、内皮细胞等混杂因素。如Sigal等[5]将孕15 d的大鼠胚肝制成单细胞悬液后，先用红细胞抗体去除红细胞，接着用OX-43/OX-44的多克隆抗体去除造血细胞以及内皮细胞，再从剩余的细胞中分选出表达白蛋白和AFP的细胞，最后通过OC-3做标记用流式细胞仪分选出多潜能的肝干细胞。Mariana等[6]对此方法进行了改进，先将Fischer 344大鼠胎肝脏置于0 ℃的不含Ca2+的HBSS液中，再将其轻柔地重悬于含有EGTA的HBSS液中，通过流式细胞仪利用ELSC的特异性表面标志物AFP、白蛋白以及胆管细胞的表面标志物CK19，将分离出的细胞分为3个亚群，最后将所获得的细胞亚群分别移植给2/3肝切除的正常F344大鼠及倒千里光碱(retrosine)处理的二肽基肽酶变异的F344大鼠进行验证，只有同时表达AFP、白蛋白和CK19的细胞群在特定的微环境中才具有干细胞的性质。

　　Suzuki等[7]根据胚胎不同发育阶段中整合素亚型在肝脏细胞呈不同表达，采用单克隆抗体和荧光激活细胞筛选获取肝干细胞。分别取怀孕不同天数的小鼠胚肝制成单细胞悬液，利用不同的细胞表面标志物将所获得的细胞分为4群，收集获得目标细胞c-kit-CD45-TER119-CD49f+CD29+，制成单细胞悬液，培养24 h后加入HGF、EGF，用免疫组织化学方法证实白蛋白阳性的细胞群出现双核，CK19阳性的细胞群形成胆管样的结构。将目标细胞植入动物体内不同部位可定向分化为肝细胞、胆管细胞、胰腺及肠上皮细胞等。

　　Kubota等[8]对一种称为STO的饲养细胞(feeder cells)采用体外克隆形成分析及流式细胞仪鉴定的方法，结果显示除成熟肝细胞克隆外，还存在主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex classⅠ，MHCI)及RT1A1阴性的细胞及MHCI低表达、ICAM-1和整合素β1阳性的细胞，虽然上述各细胞均被证实具有多潜能性，但其所处的发育阶段及体外微环境却大不相同。这些差异可能导致细胞在形态、特异标志物的表达及分化能力上表现出多样性。

　　此外Monga等[9]报道，鼠胚胎肝脏移植体在一定的条件下培养时，用Praja标记的方法发现了ELSC，最后运用微切割技术从小鼠胚肝中获得了肝干细胞。

　　2　卵圆细胞、小肝细胞及肝星状细胞的分离

　　卵圆细胞(oval cells，OC)的概念最先由Farber[10]在1956年提出。通过免疫组织化学的方法证实这种细胞高度表达的标志物有AFP、白蛋白、OV-6、SCF/c-kit、CD34、Thy-1.1、vimentin、CK7、CK8、CK18及CK19等[11]。但到目前为止，尚未发现一种特异性标志物。大多数学者认为肝OC是休眠的肝干细胞的活化形式，成年肝脏干细胞在正常情况下处于静息状态，只有当肝组织发生严重损伤或肝细胞增殖被抑制时，肝OC可能被激活。因此，若要获得大量的OC，必须先诱导急性或慢性的肝细胞损伤，同时抑制正常肝细胞的增殖。激活动物模型肝OC增殖的方法有2/3肝切除或肝毒性物质如CCL4、呋喃、2-乙酰氨基芴(2-AAF)等，小剂量乙硫氨酸加部分肝切除也能达到良好效果[12]。

　　对已建立好的动物模型，目前常采用改良的两步灌流法。Petersen等[13]先用药物使OC活化，接着灌注肝脏，两步胶原酶消化法分离出肝细胞和非实质细胞，离心后用标志物Thy-1联合磁珠分选即可获得OC。该方法的优点是纯度高，收获量大，步骤简单，成本低。Okabe等[14]在小鼠中发现了新的用以分选OC的表面标志物——上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)。EpCAM在OC和胆管上皮细胞中均表达，但其相关蛋白质TROP2仅在OC特异性表达 。然而在人体中，肝干细胞多表达间充质干细胞的标志物如CD29、 CD73、CD44、CD90和波形蛋白等[15]。

　　小肝细胞(small hepatocyte like progenitor cells，SHPC)的特点是体积小(16~28 mm)、形态类似肝细胞，在体外具有强大的克隆扩增能力，同时具有分化为肝细胞和胆管上皮细胞的双向潜能，这类细胞表达成熟肝细胞的一些标志(如白蛋白、CK8、CK18和转铁蛋白等)，但不表达胆管上皮细胞标志(如CK7、CK19和BD1)，体外进一步分化后可终止表达肝细胞抗原，转而表达胆管上皮细胞标志。SHPC一般是利用肝细胞与非实质细胞混合培养，然后直接涂片或者利用激光捕获显微切割系统(LCM)来获得，目前研究认为它可能是肝细胞的专能定向祖细胞[16]。

　　肝星形细胞(hepatic stellate cells)，又称为储脂细胞，是肝脏的一种非实质细胞，其主要生理功能为摄取并储存维生素A。以往认为激活的肝星形细胞在肝纤维化发生过程中发挥重要作用，然而近期研究证实肝星形细胞也表达干细胞标志物如CD133和Oct4，并且具有维持细胞未分化状态的信号转导通路，能够耐受CD95介导的凋亡，提示它也是一类未分化细胞，具有干细胞潜能[17]。

　　3　肝外来源的肝干细胞的分选

　　自1999年Petersen等[1]利用Y染色体、二肽基肽酶Ⅳ以及L21-6抗原作为标志物进行骨髓移植证实骨髓来源的肝干细胞存在开始，从骨髓细胞中鉴定并分选肝干细胞便成为研究的热点。肝外来源的肝干细胞主要从骨髓的造血干细胞和间充质干细胞中进行分选。Avital等[18]利用β2m和Thy-1从肝脏和骨髓中分离出一种核浆较大的β2m-/Thy-1+细胞，将该细胞移植到同系受体大鼠体内，发现它能很快分化为成熟肝细胞，体外诱导培养后表达肝干细胞标志物AFP、ALB、CK18，并具有肝干细胞部分功能(如合成尿素、白蛋白)，从而证实这种细胞在体内外均可分化为具有肝细胞表型和功能的细胞。目前在骨髓中发现了多种具有分化为肝细胞潜能的细胞亚群，如KTLS细胞(c-kithighThylowLin-Sca-1+)、CD44-CD45-HLA-c-kit-的多能成体前体细胞(multipotent adult progenitor cells，MAPC)及C1qRp+细胞(Lin-CD45+CD38-CD34+/-)等[19]。这些细胞涉及多个不同的表面标志，可能代表着骨髓干细胞的不同发育阶段或谱系中的不同分支。

　　4　展望

　　由于肝干细胞可能成为终末期肝病的潜在治疗手段，因此人们不断寻求更好的分选方法。由于目前使用的分选手段获得的肝干细胞纯度不够，准确性也有待于证实，距离临床应用还有一定的距离。当前所面临的困难主要包括：1) 尚无一种公认的特异性的肝干细胞表面标志物，不同的学者选用的标志物不同，分选纯度不高;2)目前均是根据细胞表面标志物来确定分选细胞的类型和特征，这样可能会忽略一些标志阴性却具有肝细胞分化潜能的肝干细胞，分选方法有待改进;3)肝干细胞在体内并非一成不变，尤其在肝损伤时，它处在不断的分化过程中，其标志物与分化水平间的关系还有待于深入的研究;4)哪些细胞因子参与了诱导肝干细胞定向分化的过程，其具体的机制如何尚不明了，有待于进一步研究;5)肝干细胞数量稀少，在体外培养的过程中，如何确保其未分化状态是重要课题之一;6)肝外来源的肝干细胞的发现为其应用于临床带来了希望，如何从肝外途径获取肝干细胞具有重要的现实意义。

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