荧光原位杂交法与免疫组织化学法检测乳腺癌cerbB2表达的比较

　　作者：盛薇,车向明,单涛,樊林　　作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院普外科，陕西西安

　　【摘要】目的 比较免疫组织化学法(IHC)和荧光原位杂交法(FISH)检测乳腺癌cerbB2状态的一致性。方法 选取乳腺癌石蜡标本共50例，其中以IHC法检测cerbB2蛋白表达(+)10例、()20例、()20例。以FISH法检测上述乳腺癌细胞cerbB2基因扩增情况,分析比较两种方法差异性与相关性。结果 在IHC检测乳腺癌cerbB2(+)和()时，FISH检测结果与其具有较好的一致性，总符合率为89.2%。在IHC检测cerbB2()时，FISH结果与其一致性较差，符合率仅为35.3%。结论 IHC可以作为初步筛查cerbB2表达的首选方法;IHC检测乳腺癌cerbB2(+)和()时与FISH有良好的一致性。因IHC检测cerbB2表达()时与FISH结果的一致性较差,这类患者在应用赫赛汀治疗时应做FISH确诊。

　　【关键词】 乳腺癌,cerbB2,免疫组织化学技术,荧光原位杂交技术

　　ABSTRACT: Objective To compare the consistency of immunohistochemistry (IHC) and fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting cerbB2 status in breast cancer tissues. Methods A total of 50 breast cancer paraffin embedded samples were selected, of which there were 10 cases of cerbB2 protein expression (+), 20 cases of () and 20 cases of (). FISH was used to assess the amplification of cerbB2 gene, and SPSS 13.0 software was employed to analyze the difference and consistency between the two methods. Results IHC and FISH methods had a good consistency when detecting cerbB2 (+) and () expressions in breast cancer tissues, with the coincidence rate of 89.2%. However, when IHC was used to test cerbB2 (), the result of FISH was quite different, with the coincidence rate of only 35.3%. Conclusion IHC is a preliminary method to detect cerbB2 status in breast cancer. IHC and FISH methods have a good consistency in detecting cerbB2 (+) and () status in breast cancer tissues. As detection of cerbB2 () with IHC has a different result from FISH, such patients should receive FISH confirmation for herceptin therapy.

　　KEY WORDS: breast cancer; cerbB2; immunohistochemistry; fluorescence in situ hybridization

　　乳腺癌已成为威胁女性健康的重要危险因素，如何最大限度地减少乳腺癌对广大妇女的严重危害，一直是研究的热点。目前cerbB2基因/蛋白被公认为乳腺癌的标志物，cerbB2过表达的患者容易复发、转移，且预后差、生存率低。

　　2002年美国FDA批准了一种全新的药物Herceptin，该药能有效地改善乳腺癌cerbB2过表达患者的生存。但在该药物的临床应用中，对cerbB2表达的检测至关重要。目前广泛应用的免疫组织化学法(immunohistochemistry, IHC)是否能准确判断cerbB2状态、及时筛选出乳腺癌cerbB2阳性患者进行Herceptin治疗，还存在不同的看法。因此，我们试图通过比较荧光原位杂交法(fluorescence in situ hybridization, FISH)和IHC两种方法在检测乳腺癌cerbB2表达的差异性及相关性，为Herceptin应用提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　自2008年1月起收集西安交通大学第一附属医院普外科和肿瘤外科诊治的乳腺癌患者的临床资料，从中选取IHC检测cerbB2蛋白表达(+)10例、()20例、()20例肿瘤组织石蜡标本。采用FISH法检测上述乳腺癌细胞的cerbB2基因扩增情况。50例患者均为女性，年龄30～67岁，平均45.3岁。其中单纯癌35例、髓样癌8例、浸润性小叶癌7例，切片厚度4μm。

　　1.2 方法

　　1.2.1 IHC法

　　采用SP法。cerbB2抗体购自福州迈新生物技术开发公司。每次试验均设阳性和阴性对照。

　　1.2.2 FISH法

　　采用北京金菩嘉公司的PathVysion cerbB2 DNA Probe Kit，内含cerbB2 DNA探针及CEP17探针(17号染色体着丝粒)。预处理:切片于65～75℃烤片4～6h，常规脱蜡至水化;50℃下用300g/L酸性亚硫酸钠处理组织切片20～30min;加200μg/mL蛋白酶k工作液，于37℃孵育20～30min;滴加0.2mol/L盐酸常温下置10min，2×SSC洗片;脱水;浸泡丙酮2min。标本变性:切片于(72±1)℃的变性液(700mL/L甲酰胺)中变性5min，脱水干燥。探针与样本杂交后置于预热的湿盒中，42℃保温箱中过夜杂交，DAPI复染，荧光显微镜下观察。

　　1.3 结果判断

　　1.3.1 FISH的结果判断[1]

　　癌细胞核显示蓝色荧光信号，17号染色体着丝粒(centromere)位于核内显示绿色荧光信号，cerbB2基因位于核内显示红色荧光信号。分别计数20个靶细胞核内红色荧光点(cerbB2基因的杂交信号)及绿色荧光点(CEP17的杂交信号)的总数，计算红/绿荧光点总数比值。如比值≥2，则判断为(+)，即cerbB2基因扩增;如比值<2，则判断为(-)，即cerbB2基因未扩增。

　　1.3.2 IHC的结果判断

　　根据美国临床肿瘤学会(ASCO)和美国病理学医师学院(CAP)制定cerbB2检测临床实践指南[2]，光镜下以细胞膜染成棕黄色为阳性。分为0～3级：0级(-)，无细胞染色或少于30%的肿瘤细胞细胞膜较弱染色;1级(+)，大于30%的肿瘤细胞膜部分较弱染色;2级()，大于30%的肿瘤细胞膜染色;3级()，大于30%的肿瘤细胞膜完全强染色。以2～3级染色为阳性，0～1级染色为阴性。

　　1.4 统计学处理

　　采用SPSS13.0统计学软件，用Fishers Exact Test和kappa一致性检验对IHC与FISH的检测结果进行统计学分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　10例IHC检测cerbB2蛋白表达(+)者，FISH检测cerbB2基因扩增全为(-);20例IHC检测cerbB2蛋白表达()者，FISH检测cerbB2基因扩增结果为6例(+)、3例无信号、11例(-)，其中1例为17号染色体多体，即17号染色体着丝粒绿色信号数>2;20例IHC检测cerbB2蛋白表达()者，FISH检测cerbB2扩增结果为15例(+)、2例无信号、3例(-)，其中1例17号染色体多体。除去5例无结果，剩余资料显示：在IHC检测cerbB2蛋白表达()18例中，FISH检测有15例基因扩增，两种方法检测结果的符合率为83.3%;17例IHC检测cerbB2蛋白表达()者，FISH检测有6例cerbB2基因扩增，两种方法检测结果的符合率为35.3%;IHC检测cerbB2蛋白表达(+)的10例标本中，FISH检测其基因均未扩增，两种方法检测结果的符合率为100%。将IHC检测cerbB2()、(+)者合并计算，两种方法检测结果的总符合率为89.2%，两者之间存在显著相关性(P=0.000。

　　3 讨 论

　　与cerbB2相对应的人类基因定位于人染色体17q21，编码185ku的跨膜糖蛋白(p185)[3]。自从证实cerbB2与乳腺癌患者的预后及化疗、激素治疗的效果及Herception的治疗方式的抉择密切相关以来，此方面的研究越来越多，临床上也越来越重视乳腺癌组织中cerbB2状态的检测。目前IHC及FISH是美国FDA针对Herception的治疗而推荐的2种用于石蜡组织的检测方法[4]。IHC技术因其具有简便、廉价、快速等特点，而成为目前病理学实验室检测cerbB2蛋白表达的首选方法。但由于IHC本身的固有特点，例如标本固定、抗原修复、抗体差异以及结果主观判读等，影响了IHC的准确性。FISH则具有IHC不具备的优点，检测的DNA稳定性好，实验操作过程中受到的影响较小，特别是FISH结果的定量判读，尽量避免了主观上的误差。被公认为是目前cerbB2基因扩增状态检测的金标准。

　　Herceptin于1998年被美国FDA批准用于乳腺癌的临床治疗中。目前主要用于治疗cerbB2基因扩增或过表达且伴腋窝淋巴结转移的乳腺癌患者[56]。通常认为cerbB2检测结果为强阳性及FISH检测基因扩增的浸润性乳腺癌可被确定为cerbB2阳性，并用于指导是否选择赫赛汀单抗进行治疗[78]。而cerbB2蛋白中度阳性的乳腺癌患者中，多数患者FISH检测cerbB2基因未扩增，但也有一定数量扩增，因此美国FDA要求必须用FISH技术检测出该基因的扩增才能进行赫赛汀的治疗。

　　本实验对50例病理诊断为乳腺癌的组织病理切片分别行IHC和FISH检测，结果显示：IHC检测cerbB2为(+)、()时，两种方法检测结果的总符合率为89.2%，与文献报道的90%相近[910]。其中IHC检测cerbB2()18例样本中(去除2例无结果)，有15例FISH结果为阳性，说明大多数cerbB2蛋白过度表达的肿瘤，其cerbB2基因存在扩增[10];IHC检测cerbB2(+)者FISH检测的结果均为阴性，说明大多数cerbB2蛋白未表达的肿瘤，其cerbB2基因不存在扩增;IHC检测cerbB2()17例标本中(去除3例无结果)，有11例FISH检测结果为阴性，两种方法检测结果的符合率较差，仅35.3%(6/17)的经FISH检测有基因扩增，与PEREZ等[11]报道相近。认为IHC检测cerbB2()病例中较高的假阳性结果与AF液固定、石蜡包埋、长期保存后肿瘤组织抗原丢失及cerbB2免疫反应性下降有关。也有研究认为与17号染色体多体[12]，或与基因转录或翻译水平的异常上调导致基因的扩增而蛋白高表达有关[13]。然而在本次试验中与IHC检测cerbB2(+)的病例相比，大多数缺乏基因扩增的IHC cerbB2()病例并无17号染色体数量的明显增多。

　　文献报道，cerbB2检测结果为FISH(+)而IHC(-)患者的生存期较FISH和IHC均为阴性患者的生存期短[14]。为了排除药物的干扰，MNARD等[15]针对未经任何治疗的淋巴结阴性乳腺癌患者cerbB2状态的研究显示，cerbB2基因扩增比cerbB2蛋白表达对于预后的意义更加明确，因而他们认为只有cerbB2基因扩增才是一个独立的预后因子。对于IHC检测cerbB2()而FISH检测cerbB2基因扩增的患者，采用Herceptin治疗收到了良好的效果[16]。这些研究结果提示，由于FISH和IHC两种检测方法本身固有的特点及结果判读标准等方面的差异，在检测cerbB2基因和蛋白结果不一致时，FISH检测结果比IHC更可靠、更值得信赖。

　　按照本文中采用的FISH结果判读标准[1]，本组cerbB2基因扩增与无扩增中均有1例17号染色体多体。17号染色体非整倍体即每个细胞中17号染色体数多于或少于2个，染色体的非整倍体是癌细胞普遍存在的遗传学特征之一。据LAL等[13]的研究显示大约50%的浸润性乳腺癌患者癌细胞的17号染色体为非整倍体。吕亚莉等[17]认为17号染色体多体可能与乳腺癌患者的预后不良有关。对于IHC检测cerbB2()但其基因无扩增的患者来说，约50%以上是17号染色体多体所致，而HIC检测cerbB2()与多体无明显相关。除此之外，还有一些文献报道乳腺癌中17号染色体多体的出现可能与治疗预后有一定的关系。究竟非整倍体与cerbB2基因扩增、治疗预后反应之间是否存在一定的关系，将依赖于更多研究数据的积累。

　　综上所述，在IHC检测cerbB2结果为(+)和()乳腺癌肿瘤组织中，IHC法与FISH法具有良好的一致性，可用IHC代替FISH进行cerbB2状态评价。IHC结果阴性或弱阳性的乳腺癌表示没有cerbB2过度表达，同时亦可能提示cerbB2基因未扩增，此时再作FISH的意义不大，也很可能不太适合使用赫赛汀治疗;IHC检测cerbB2结果为()则有必要进行FISH检查，因为IHC有假阳性的存在，即cerbB2蛋白表达不一定存在基因扩增，应最终根据FISH来评价cerbB2基因的扩增情况，筛选cerbB2基因扩增病例进一步行赫赛汀治疗。

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