胰岛素对缺氧/复氧神经元上的HMGB1、NFκB表达的影响

作者：周艳丽  滕军放 娄季宇    作者单位：1)郑州市第十人民医院 郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院神经内科 郑州 450052 3)郑州大学第二附属医院神经内科 郑州 450014 　　【摘要】  目的 探讨胰岛素(insulin，In)对缺氧/复氧诱导新生大鼠皮质神经元损伤的保护作用及其机制。方法 将培养7 d的大鼠皮质神经元随机分为3组，A组为正常对照组，B组单纯采用缺氧/复氧(H/R)，C组采用In预处理加H/R，各组在H/R后0、3、6、12、24h各时间点，以TUNEL比较各组凋亡细胞，免疫组化比较各组高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein box 1，HMGB1)、核因子κB(nuclear factor κB，NFκB)表达。 结果 ①B组凋亡神经元明显多于A组，C组显著少于B组，3组比较差异有统计学意义。②B组HMGB1、NFκB的表达较正常对照组明显增加， C组HMGB1、NFκB表达较B组明显减少。结论 In可使H/R后神经元HMGB1、NFκB表达降低，抑制神经元凋亡，这可能是其脑保护作用的机制之一。

　　【关键词】  神经元;缺氧/复氧;胰岛素;HMGB1;NFκB;凋亡

　　Effect of insulin on HMGB1 and NFκB expressed in cultured neurons after hypoxia/reoxygenation Zhou Yanli Teng Junfang，Lou Jiyu.The Tenth People's Hospital of Zhengzhou, Zhengzhou 450052，China

　　【Abstract】 Objective To explore the protective effects of insulin(In) on injured neurons induced by H/R and the mechanisms of that.Methods Cortical neurons cultured for 7 days were randomly divided into A (normal control group), B (H/R alone), C (pretreatment with In, and H/R) 3 groups. Then the apoptotic neurons were counted by TUNEL, and the expressions of HMGB1, NFκB were observed by immunocytochemical technique on 0、3、6、12、24h timepoints after H/R. Results ①The apoptotic neurons in group B were more than those in group A, and they were less in group C than those in group B. ②The expressions of HMGB1 and NFκB were increased in group B than those in group A. And they were lower in group C than those in group B.Conclusion In could decrease the expressions of HMGB1 and NFκB, and inhabit neuronal apoptosis after H/R, this may be one of the mechanisms in which In exerts its neuroprotection.

　　【Key words】 Newron;Hypoxia reoxygenation;Insulin;HMGBI;NFκB;Apoptosis

　　近年来研究发现In除了发挥调节血糖的作用外, 对缺血性脑血管病脑损伤有保护作用，但其作用机制尚未完全明了。本实验拟通过体外培养神经元，以缺氧/复氧(hypoxia/ reoxygenation，H/R)模拟缺血再灌注损伤(ischemiareperfusion injury，IRI)，观察In对神经元凋亡、HMGB1和NFκB表达的影响，探讨In对中枢神经系统保护的作用机制，为其治疗急性缺血性脑血管病提供理论和实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 出生24h内的SD大鼠(郑州大学动物中心);抗NSE、抗NFκB、抗HMGB1多克隆抗体(博奥森);TUNEL检测试剂盒(Roche);SP免疫组化试剂盒(博奥森);正规胰岛素注射液(上海第一生化)。

　　1.2 原代大鼠皮质神经元的培养与鉴定 采用Lee JM 的方法[1]：取新生SD 大鼠脑组织制成细胞悬液，接种在24或96 孔板中培养。7d后用NSE抗体进行细胞免疫组化染色，计数阳性神经元达85% 以上符合实验要求。

　　1.3 实验分组 将培养7d的神经元随机分为3组。A组：将培养液换为有糖Earle’s液后培养;B组：单纯 H/R，将培养液换为无糖Earle’s液放入缺氧袋中，通入95% N2+5% CO2后继续培养;C组：予1mU/L 的In预处理1h后再予H/R。50min后以上3组重新换回正常培养基，继培养24h。分别于复氧后 0、3、6、12、24h各时间点检测凋亡神经元、HMGB1和NFκB的表达。单纯H/R模型成功标准：H/R 0、24h MTT检测细胞存活率，分别下降至90%、60%以下。

　　1.4 TUNEL法检测凋亡细胞 严格按照说明书操作。用已知的阳性图片做阳性对照，阴性对照采用试剂盒中2液代替反应液。阳性凋亡细胞被染为棕黄色。光学显微镜下，每个培养孔随机选取3个不连续的视野，计数200个细胞中染色的细胞数。

　　1.5 细胞免疫组化检测HMGB1和NFκB的表达 严格按照说明书操作。用已知的阳性图片做阳性对照，阴性对照采用PBS液代替一抗。HMGB1阳性细胞胞浆被染为棕黄色, NFκB阳性细胞胞核被染为棕黄色。光学显微镜下，每个培养孔随机选取3个不连续的视野，计数200个细胞中染色细胞的数。

　　1.6 统计学方法 采用SPSS 10.0 软件分析，数据以±s表示，多组间计量资料比较采用随机测量的方差分析。用LSDt检验进行两两比较，α=0.05为检验水准。

　　2 结果

　　2.1 培养7d神经元NSE鉴定 阳性率为(91.70±3.60)%。

　　2.2 各组大鼠皮质神经元凋亡数目 见表1。表1 各组大鼠皮质神经元凋亡数目比与A组比较，★P<0.05;与B组比较，☆P<0.05

　　2.3 各组大鼠皮质神经元HMGB1的表达 见表2。表2 各组大鼠大脑皮质神经元HMGB1胞浆表达的比较与A组比较，★P<0.05;与B组比较，☆P<0.05

　　2.4 各组大鼠皮质神经元NFκB的表达 见表3。表3 各组大鼠皮质神经元NFκB胞核表达的比较 与A组比较，★P<0.05;与B组比较，☆P<0.05

　　3 讨论

　　Goldberg MP等[2]的方法能很好的模拟脑IRI，本实验依据此建立体外神经元IRI模型。

　　In已广泛应用于临床，在糖尿病治疗中发挥着及其重要的作用。近年来研究表明[3]胰岛素还可减轻缺血性脑损伤，该作用独立于它的降血糖作用之外。In能使缺血性脑卒中缺血半暗区血流增加， Ca2+超载减轻，兴奋性氨基酸及NO的毒性作用抑制;增强脑源性神经生长因子作用;可通过PI3K/Akt途径使JNK1/2、Caspase3等的表达下调，Bcl2表达上调而抑制神经细胞凋亡，起到脑保护作用。本研究发现，与A组相比，B组H/R后3h凋亡细胞增多，并随着H/R时间的延长逐渐增多，提示缺血再灌注导致了神经元凋亡，这与脑缺血再灌注后神经细胞发生凋亡的规律基本一致。C组应用In预处理后，发现凋亡细胞较B组明显减少。这提示In可抑制细胞凋亡，减轻缺血再灌注对神经元的损伤。

　　HMGB1是一种非组蛋白DNA结合蛋白，近期研究发现HMGB1在IRI中起重要作用。有动物实验[4]观察到HMGB1在脑缺血再灌注中由损伤和坏死的神经元胞核中转移至胞浆再释放至胞外，导致神经元的坏死和凋亡，抗HMGB1单克隆抗体可缩小梗死区域，减轻脑损伤。本实验发现，B组神经元胞浆HMGB1表达较A组显著增加，C组应用In预处理后神经元胞浆HMGB1表达明显减少，提示In可抑制神经元HMGB1的胞浆表达，从而减轻神经元凋亡损伤。

　　NFκB是一种真核转录因子，静息状态是存在于细胞质中，激活后移位至胞核与DNA结合产生一系列生物学作用。研究表明NFκB持续激活后可通过调控细胞周期、促进细胞因子释放、诱导促凋亡基因的表达等导致神经元凋亡[5]。本实验发现，与A组相比，B组神经元胞核NFκB表达明显增加;C组应用In预处理后神经元胞核NFκB表达较B组明显减少;提示In可通过下调神经元NFκB的胞核表达减少神经元凋亡。

　　综上In可减轻H/R所致神经元凋亡，对脑IRI有保护作用，机制之一可能与抑制神经元HMGB1的胞浆表达和NFκB的胞核表达有关。

【参考文献】　　[1] Lee JM, Shih AY, Murphy TH, et al. NFE2related factor2 mediates neuroprotection against mitochondrial complex I inhibitors and increased concentrations of intracellular calcium in primary cortical neurons[J]. J Biol Chem, 2003, 278(39): 3794837956.

　　[2] Goldberg MP, Choi DW. Combined oxygen and glucose deprivation in cortical cell culture: calciumdependent and calciumindependent mechanisms of neuronal injury[J]. Neurosci,1993,13(8):35103524.

　　[3] Hui L, Pei DS, Zhang QG, et al. The neuroprotection of insulin on ischemic brain injury in rat hippocampus through negative regulation of JNK signaling pathway by PI3K/Akt activation[J]. Brain Res, 2005, 1052(1):19.

　　[4] Liu K, Mori S, Takahashi HK,et al. Antihigh mobility group box 1 monoclonal antibody ameliorates brain infarction induced by transient ischemia in rats[J]. The FASEB Journal, 2007, 21(14):39043916.

　　[5] 李军, 娄季宇, 张磊. 雌激素对大鼠脑缺血再灌注损伤脑组织NFκB表达和细胞凋亡的影响[J].中国实用神经病杂志，2007, 10(3):100102.

　　[6] Aoki E, Yano R, Yokoyama H, et al. Role of nuclear transcription factor kappa B (NFkappaB) for MPTP (1methyl4phenyl1,2,3,6tetrahyropyridine)induced apoptosis in nigral neurons of mice[J]. Exp Mol Pathol, 2009, 86(1): 5764.