5LOX mRNA和COX2 mRNA在结直肠癌中的表达及二者的相互关系

　　作者：柳长明 于威 刘铜军 作者单位：(吉林大学第一医院普外科，吉林 长春 130021)

　　【摘要】目的 研究5脂氧合酶(5LOX)和环氧合酶2(COX2)在结直肠癌中的表达及二者的相互关系。方法 用RTPCR检测39例结直肠癌标本中5LOX mRNA和COX2 mRNA的表达。结果 5LOX mRNA和COX2 mRNA在结直肠癌组织中的表达率分别为84.6%(33/39)及76.9%(30/39)，均与结直肠癌临床分期、肿瘤大小、肿瘤分化程度有关。但两者无相关性(P>0.05)。结论 5LOX mRNA和COX2 mRNA在结直肠癌组织中表达增高，提示了在研究结直肠癌治疗和预防时可采取对代谢途径抑制这一新方向。

　　【关键词】 5脂氧合酶;环氧合酶2;结直肠癌

　　研究已证实，高脂肪饮食与特定器官包括乳腺、胰腺、结肠、前列腺等发病率及肿瘤生长相关联〔1〕。也证实花生四烯酸、多不饱和脂肪酸代谢是通过环氧合酶(COX)途径或脂氧合酶(LOX)途径，产生一系列促炎性反应物质——类花生酸类物质，包括前列腺素、血栓烷素、白细胞三烯等，在人类癌症发生、发展中发挥重要生物效应〔2〕。国内关于检测5LOX mRNA 和 COX2 mRNA在结直肠癌组织中的表达，及二者相互关系尚未见报道。本文旨在探讨COX和LOX与结直肠癌临床表现及病理学特征相关性，进一步研究结直肠癌发病机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 新鲜的39例结直肠癌标本由吉林大学第一附属医院结直肠肛门外科提供，其中男20例，女19例，年龄40～75岁。结肠癌22例、直肠癌17例。Ducks分期A+B期13例、C+D期26例，行根治性切除术35例、行姑息性切除术4例。 mRNA纯化试剂盒购自QIAGEN公司。逆转录试剂盒购自Invitrogen公司。引物由上海生物工程公司合成。

　　1.2 方法 新鲜癌组织加变性液粉碎后，经Trizol法提取总RNA，利用 mRNA Purification Minikit纯化试剂盒从总RNA中纯化 mRNA，然后用SuperScriptTMII试剂盒，进行 mRNA的逆转录反应合成cDNA。从Genbank查得5lox 和cox2的 mRNA全序列，根据所提供的信息，找到所有外显子序列，设计表达鉴定引物，鉴定引物跨过多个内含子，以防止由于基因组污染造成的假阳性PCR结果。各鉴定用引物序列如下：5LOX：5′gtcgaggttgtcctgag3′，5′ctgctccaagctgagctg 3′;COX2：5′cagccatacagcaaatcc3′,5′gatgcgtgaagtgctg3′，PCR反应(25 μl)：应用Invitrogen PCR kit进行。反应体系如下：10×PCR buffer 2.5 μl、100 mmol/L dNTP 2 μl、50 mmol/L MgCl2 1 μl、DNA polymerase 0.8 μl、5′引物(100 pmmol/L)0.5 μl、3′引物(100 pmmol/L)0.5 μl、cDNA 0.5 μl、无菌水17.2 μl。反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸1 min，进行30个循环。循环结束后，72℃反应7 min，最后反应停止在10℃，琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物，以βactin做为内参。

　　1.3 统计学处理 应用Kodak ID 3.5成像分析软件计算泳道中5LOX和COX2产物条带灰度值，并与βactin灰度值三代作为其相对含量。采用SPSS11.0统计软件，应用单因素方差进行统计学分析。

　　2 结果

　　2.1 5LOX mRNA和COX2 mRNA在结直肠癌组织中的表达及与临床病理特征的关系 39例结直肠癌组织中33例扩增出5LOX mRNA 504 bp的条带，阳性表达率为84.6%(33/39);30例扩增出COX2 mRNA 540 bp的条带，阳性表达率为76.9%(30/39)。5LOX mRNA 和 COX2 mRNA在结直肠癌组织中的表达与结直肠癌临床分期、肿瘤大小、肿瘤分化程度有关，与年龄、性别、肿瘤位置、大体分型无关(见表1，图1、图2)。

　　2.2 5LOX mRNA和COX2 mRNA在结直肠癌组织中的关系 5LOX mRNA 阳性33例(84.6%)，阴性6例;COX2 mRNA阳性30例(76.9%)，阴性9例;两者共阳性表达24例，共阴性表达0例。两者表达无相关性(P>0.05)。

　　表1 5LOX mRNA 和 COX2 mRNA在结直肠癌组织中的表达及与临床病理特征的关系(略)

　　1，3，5：5LOX;2，4，6：βactin。

　　图1 结直肠癌患者5LOX表达电泳图(略)

　　1，3，5：COX2;2，4，6：βactin。

　　图2 结直肠癌患者COX2表达电泳图(略)

　　3 讨论

　　5LOX和COX2是花生四烯酸代谢过程中两个关键酶，代谢产生重要生物活性脂肪酸、类花生酸类物质如前列腺素、白细胞三烯等，这些物质在炎症反应过程及变态反应性疾病中具有特定病理生理特性〔3〕。近20年，大量实验性和临床前证据表明花生四烯酸衍生物是肿瘤发生发展的重要物质〔4〕，一些实验资料指出COX2可以作为抗结直肠癌靶向治疗靶点，选择性COX2抑制剂作为一种新的抗肿瘤药物目前正在评估中〔5〕。而脂氧合酶催化产物，白细胞三烯和羟二十四碳四烷酸在人类癌症发生进展中发挥更加深远的生物学效应〔6〕,在人类许多癌细胞株和组织中可以检测到脂氧合酶和他们代谢产物高表达如前列腺、膀胱、乳腺、肺等〔7〕，这一过度表达和肿瘤细胞增殖、阻止编程性细胞死亡、肿瘤血管发生具有重要相关性〔8〕，5LOX表达常伴随基质金属蛋白酶2活性和血管内皮细胞生长因子过度表达，二者是肿瘤发生关键的血管性因素〔9〕，因此在癌肿组织检测5LOX和COX2表达情况和相互关系具有重要临床意义。本文检测5LOX mRNA 和 COX2 mRNA在结直肠癌组织中的表达情况发现，二者均在结直肠癌组织中高表达，与上述文献报道相一致，且与结直肠癌临床分期、肿瘤大小、肿瘤分化程度呈正相关，与年龄、性别、肿瘤位置、大体分型无关，这更进一步证实了5LOX和COX2在人类癌症中显示出相似的表达和功能。5LOX和COX2在癌肿组织中均为阳性，则癌肿组织平均尺寸越大，这可能被看作是花生四烯酸两个代谢旁路并用效果〔10〕，以及两个酶有如此相近作用原理和酶底物，也可能出现一个酶途径被阻断而激活另一酶途径〔11〕。在实验中5LOX和COX2均有一定阴性表达率，二者既有交叉又有补充，提示了在研究结直肠癌治疗和预防中采取对代谢途径的抑制，提供了一个新的治疗方法和途径，并且采纳两个代谢旁路共同抑制剂较单一使用疗效更为确切。

　　【参考文献】

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　　10 Cao Y,Prescott SM.Many actions of cyclooxygenase2 in cellular dynamics and in cancer〔J〕.J Cell Physiol，2002;190:27986.

　　11 Gavett SH，Madison SL，Chulada PC,et al.Allergic lung responses are increased in prostaglandin H synthasedeficient mice〔J〕.J Clin Invest，1999;104:72132.