大肠癌前哨淋巴结定位切除及其微转移检测

　　作者：张敏, 谭最， 菅志远， 江斌， 兰明银， 曾少波， 李恒， 王耕

　　[摘要] 目的：探讨大肠癌前哨淋巴结定位切除及检测淋巴结微转移的方法，并分析其临床意义。方法：对60例大肠癌患者采用亚甲蓝染法淋巴结示踪，寻找染色的前哨淋巴结,切除后行HE染色和细胞角蛋白20免疫组织化学检测,并与前期直接行淋巴结清扫的60例患者对比。 结果：60例中可识别前哨淋巴结者54例,检出率为90.0%，高于前期直接清扫组的24例(40%)(P<0.05);其中常规HE染色检出36例阳性，18例前哨淋巴结阴性者应用免疫组织化学检测，6例检出有微转移灶,其阳性率大大高于对照组(P<0.05)。结论：联合应用亚甲蓝和细胞角蛋白20进行大肠癌前哨淋巴结定位优于单用其中一种方法;免疫组化方法是检测淋巴结微转移的敏感方法;前哨淋巴结定位和微转移的检测对大肠癌的治疗有重要意义。

　　[关键词] 大肠癌;淋巴结示踪;前哨淋巴结;微转移

　　Lymphatic Mapping，Sentinel Node Biopsy and Micro-metastasis Detection in the Patients with Colorectal Cancer and their Clinical Significance

　　ZHANG Min,TAN Zui,JIAN Zhi-yuan,JIANG Bin,LAN Ming-yin,ZENG Shao-bo,LI Heng,WANG Geng

　　(Department of General Surgery,Zhongnan Hospital,Wuhan University,Wuhan,Hubei 430072;Department of General Surgery, Taihe Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000,China)

　　Abstract: Objectives To identify the sentinel lymph nodes(SLN)in patients with colorectal cancer and evaluate their clinical significance.Methods Sixty patients with colorectal cancer underwent lymphatic mapping using methylene blue staining,the SLN was identified and removed,the micro-metastases in sentinel lymph node were also detected with HE and immunohistochemical staining technique.Results Fifty-four SLN were successfully identifed in sixty patients,with a detection rate 90.0%,higher than that of control group;thirty-six positive SLN were dectected by HE staining,six micro-metastases in Sentinel lymph node were found in eighteen negative SLN with Cytokeratin 20 immuno-histochemical staining. Conclusion The success rate achieved by combining methylene blue staining and cytokeratin 20 immunohistochemical staining is higher than that by using either technique alone;immunohistochemical assay is a sensitive way to detect micrometastases in lymph nodes,and this may have clinical significance for the treatment of colorectal cancer.

　　Key words: Colorectal cancer; Lymph nodes trace; Sentinel lymph node; Micrometastasis

　　周围淋巴结的转移情况直接关系到肿瘤的病理分期、预后判断和术后辅助治疗方案的选择。传统的大肠癌前哨淋巴结 (Sentinel lymph node，SLN) 活检可能会将已有转移的淋巴结遗漏在切除的标本或体内，而无法检出淋巴结微转移灶(1ymph node micrometastasis，LNMM)[1];细胞角蛋白(Cytokeratinl 20,CK20)作为细胞骨架广泛分布于胃肠上皮组织及其来源的肿瘤组织胞浆中,在大肠癌中高度表达[2]。如何联合应用这两种方法对前哨淋巴结进行准确定位，并了解阴性淋巴结的微转移情况，本文应用亚甲蓝在术中对大肠癌进行前哨淋巴结的示踪和定位，并结合CK20免疫组化法(Immunothistochemical,IHC)对其进行淋巴结微转移LNMM检测，以探讨SLN在大肠癌的临床意义。

　　1 资料和方法

　　1.1 临床资料2004年10月-2006年6月在我院住院行肿瘤切除手术的大肠癌患者60例为亚甲蓝组，其中男性36例，女性24例，年龄32~78岁，平均年龄55岁。部位：升结肠癌16例，横结肠癌4例，降结肠癌14例，乙状结肠癌20例，直肠上段癌6例。病理分型：高分化腺癌20例，中分化腺癌26例，低分化腺癌14例。另以2005年之前未行亚甲蓝显影的60例大肠癌患者做对照组，两组患者在年龄、性别以及肿瘤部位之间无明显差别。

　　1.2 试剂所用亚甲蓝系江苏济川制药集团公司生产,批号H32024827，安瓿瓶装，2 ml/支,浓度1%(20 mg/2 ml)。细胞角蛋白抗体(CK20 鼠抗人，即用型)、抗原修复液及SP试剂盒均购自福州迈新生物制品公司。

　　1.3 方法60例患者在全麻下手术，开腹探查腹腔，证实无腹腔以及肝脏广泛转移后，距肿瘤边缘1～1.5 cm上下左右四点，在肠壁粘膜下层及浆肌层分别注射亚甲蓝染色剂0.5 ml，共计2 ml，注射完毕10～20 min后开始手术根治。凡术中被蓝染的淋巴结均确定为SLN，切除后送检行HE染色，如结果阴性，则用细胞角蛋白抗体(CK20，鼠抗人)行免疫组化(IHC)检测，严格按照试剂盒操作。结果判断：CK20以胞浆黄染为阳性。对照组行常规SLN辨认、清扫，病理学检验方法同亚甲蓝组。

　　1.4 统计学处理 所有统计学处理均采用四格表χ2检验,用SPSS 13.0软件完成统计学分析,以P<0.05有显著性差异。

　　2 结果

　　2.1 淋巴结转移分析对照组(未行亚甲蓝示踪)60例大肠癌患者术中共取得淋巴结874枚。HE染色发现22例SLN转移，CK20检测又发现2例，共有24例(40%)患者为阳性。

　　亚甲蓝组60例大肠癌患者中，共取得淋巴结812 枚，54例发现SLN，检出率为90.0%，高于前期直接清扫组的24例(40%)(P<0.05)。经HE染色则发现有36例出现SLN微转移,检出率为66.67%(36/54)，18例未发现。但用CK20作组化染色检测又发现6例患者有淋巴结转移灶,故SLN阳性患者增至42例,占总检测患者的77.78%(42/54)。统计学分析显示，两者在阳性率方面存在显著差异(P<0.05)，见表1。

　　2.2 SLN形态学变化对各组送检的SLN，肉眼观察淋巴结被蓝染，HE染色可见转移的淋巴结蓝染，大肠癌细胞CK20染色时胞浆呈黄色，以周边部最显著(如图1、图2)。

　　表1 大肠癌亚甲蓝示踪前哨淋巴结肿瘤一般情况分析(略)

　　3 讨论

　　大肠癌是胃肠道常见的恶性肿瘤。癌细胞在腹腔内、淋巴结、骨髓及外周血中的微转移是导致大肠癌术后复发转移的重要因素[3]。前哨淋巴结SLN是恶性肿瘤淋巴结远处转移的第一站淋巴结，有学者认为大肠癌淋巴结远处转移亦遵循这一模式[4]，正确识别、判断淋巴转移程度并合理清扫就显得十分重要。但临床上对肿瘤淋巴结切除往往是根据术者自己的经验估计清扫的部位和范围,受各种主观、客观因素的影响其准确性并不高。这种盲目性可能导致虽然清扫了大量的淋巴结，而有转移的淋巴结未被清扫或未完全清扫。因此识别SLN对于确定合理术式有非常重要的意义,而淋巴结显像技术(sentinel lymph node mapping,SLNM)对于寻找那些最早被转移的淋巴结有很高的准确性。SLNM对淋巴结转移的定位和示踪有三种方法：蓝染法、同位素法和联合法。后二者检出率较高,但需设备特殊,价格昂贵,有放射污染危险。蓝染法常用的染料是亚甲蓝,能较久地维持淋巴结蓝染状态(可达6 h),其通过淋巴管扩散速度快，往往在瘤体注射后30 min之内即可扩散至肿瘤周围的淋巴结，因此并不增加手术时间;且具有无需特殊设备,操作简便,费用低廉,能提供可视性导向等优点，常常被临床医生选用以识别大肠癌SLN。陈夏[5]等报道214例大肠癌的淋巴结转移阳性患者为57%，淋巴结转移数的百分率为9.69%，均低于本研究结果，进一步肯定了亚甲蓝染色在判定淋巴结清扫范围的意义。尽管如此，但因为胃肠道肿瘤存在着复杂的淋巴引流系统和淋巴结转移的多向性及“跳跃性”，有时对进展期肿瘤行根治术也可能因切除范围不够而存留转移灶，但亦并不构成对SLNM的障碍，将SLNM用于大肠癌LNMM检测是简单、有效的方法[6]。传统上对SLN的常规检测是行组织切片HE染色，该方法能查及淋巴结的大部分组织，但有可能忽略淋巴结微转移的存在，检测SLN是否存在微转移癌目前常用的方法有免疫组织化学(IHC)法、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR法)等，IHC法可以发现常规HE染色所不能发现的微转移灶的存在，RT-PCR会使假阴性率降至最低，因而对LNMM检测常常可以通过组合使用来提高检测准确性。细胞角蛋白(CK20) 作为细胞骨架广泛分布于胃肠上皮组织及其来源的肿瘤组织胞浆中,在大肠癌中高度表达,在正常间叶组织中无表达,且在侵袭、转移、扩散到其它组织器官时始终保持稳定，此特点使其成为了检测大肠癌微转移的敏感而又特异的肿瘤标志物。刘波[7]运用该方法分析了331 枚HE染色呈阴性淋巴结，用CK20重新检查又发现36枚淋巴结存在微转移灶。说明单纯HE染色并不能全面的反映SLN的真实情况，必须结合IHC检测才可以提高检测微转移癌的准确性。本研究亦证实联合应用亚甲蓝和CK20进行大肠癌前哨淋巴结定位优于单用其中一种方法,免疫组化方法是检测淋巴结微转移的可靠而又敏感的方法。本研究通过应用亚甲蓝，并结合CK20免疫组化法在术中对大肠癌进行SLN的示踪、定位和LNMM检测，可以简便、快速地发现SLN微转移灶，以对肿瘤进行正确的临床分期，为合理制定手术方案、指导手术清扫淋巴结及后续治疗提供了科学保证。在手术过程中还必须注意以下几点：①在打开腹腔探查完毕后，宜尽早注射亚甲蓝，以便在开始清扫淋巴结前有足够的扩散时间;必须在肿瘤周围注射，仅仅瘤体内注射往往不宜扩散，会出现假阴性。②亚甲蓝注射剂量不宜过多，否则造成组织大片兰染，往往影响清扫效果;清扫时，必须仔细寻找兰染的区域或线条，并适当根据指示的方向扩大清扫范围，以免遗漏转移的淋巴结。

　　(文中图1~2见封四)(略)

　　[参考文献]

　　[1] 程黎阳，陈晓东，用宏锋，等.专利蓝示踪胃癌前哨淋巴结及其微转移检测[J].肿瘤,2006,26(l)：71-73.

　　[2] Wong LS,Cantrill JE,Odogwu S,et al.Detection of circulating tumour cells and nodal metastasis by reverse transcriptase-polymerase chain reaction technique[J].Br J Surg,1997,84(6):834-839.

　　[3] 龚丽明.大肠癌微转移检测的现状及展望[J].大肠肛门病外科杂志，2OO3，9(2)：137-142.

　　[4] Tsioulias G，Wood TF，Morton DL，et a1.Lymphatic mapping and focused analysis of sentinel lymph nodes upstage gastrointestinal neoplasms[J].Arch Surg，2000，135(8)：926-932.

　　[5] 陈 夏,陈惠珠.大肠癌临床特征与淋巴结转移规律分析[J].现代肿瘤医学,2005,13(6):770-771.

　　[6] Mulsow J,Winter DC,O′Keane JC,et al.Sentinel lymph node mapping in colorectal cancer[J].Br J Surg,2003,90(6):659-667.

　　[7] 刘 波,陈道瑾.角蛋白单克隆抗体免疫组化法检测大肠癌淋巴结微转移的研究[J].中国医师杂志,2001,3(1):13-15.

　　(武汉大学附属中南医院普外科,湖北 武汉 430072; 郧阳医学院附属太和医院普外科,湖北 十堰 442000)