乳腺癌组织中EMS1 mRNA检测的临床意义

　　作者：盛 建1， 徐 青2， 陈锦鹏2， 何志贤2 作者单位：(1.江苏大学附属人民医院普通外科， 江苏 镇江 212002; 2.南通大学附属医院普通外科， 江苏 南通 226021)

　　【摘要】 目的： 通过检测EMS1基因在乳腺癌组织中的表达，结合乳腺癌分子分型及各项临床病理参数，分析EMS1 mRNA表达水平在乳腺癌组织检测中的临床意义。方法： 采用RTPCR法检测94例乳腺癌及癌旁组织EMS1 mRNA相对含量，以乳腺癌癌旁组织EMS1 mRNA的相对表达量均值为界限, 乳腺癌组织分为高表达组和低表达组;采用ELIVISON二步法，对乳腺癌组织进行免疫组化分析并根据基因聚类分析进行分子分型;分析EMS1基因表达与乳腺癌分子分型及各项临床病理参数的关系。结果： 乳腺癌组织与癌旁组织中EMS1 mRNA平均表达水平为0.578±0.105和0.397±0.079,高表达率为60.6%(57/94)。Basallike型乳腺癌中EMS1平均表达水平最高，与其他分子分型比较,差异有统计学意义。EMS1 mRNA高表达与患者年龄≥50岁、绝经后和腋淋巴结转移成正相关,与肿瘤大小、肿瘤分级和TNM分期状况无关。结论： EMS1基因可能是乳腺癌的一种新预后指标。

　　【关键词】 乳腺癌; EMS1; 逆转录聚合酶链式反应; 腋淋巴结转移

　　Expression and clinical significance of EMS1 mRNA in breast cancer

　　SHENG Jian1, XU Qing2, CHEN Jinpeng2, HE Zhixian2

　　(1.Department of General Surgery, the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University， Zhenjiang Jiangsu 212002; 2.Department of General Surgery, the Affiliated Hospital of Nantong University， Nantong Jiangsu 226021， China)

　　[Abstract] Objective: To detect the expression of EMS1 gene in breast cancer tissues, combining the molecular type and clinicopathological parameters to evaluate the clinical significance of EMS1 expression in breast cancer. Methods： The expression of EMS1 was detected by RTPCR in surgical neoplastic and paraneoplastic breast tissues from 94 cases of breast cancer patients. The ER,PR,Her2/neu,EGFR status was detected after operation by ELIVISON twostep immunohistochemistry method and according to gene expression clustering analyze breast cancer molecular type，breast cancer tissues were divided into EMS1 mRNA high expression group and low expression group based on the average value of all paraneoplastic breast tissues and the correlation between EMS1 gene expression, the molecular type and clinicopathological parameters of breast cancer was analyzed. Results： The average expression level of the EMS1 mRNA was 0.578±0.105 and 0.397±0.079 in all neoplastic and paraneoplastic breast tissues，and 60.6%(57/94) of all neoplastic cases was EMS1 mRNA high expression.EMS1 average expression in the basallike carcinoma of the breast was the highest than the four other molecular types and had significant difference. The high expression of EMS1 mRNA was positively correlated with age≥50, postmenopausal status,axillary lymph nodes metastasis. The expression of EMS1 mRNA was independence of tumor size,tumor grade and TNM stage. Conclusion： EMS1 gene may be a new prognosis factor of breast cancer.

　　[Key words] breast cancer;EMS1; RTPCR; axillary lymph nodes metastasis

　　EMS1基因是由Schuuring等[1]于1992年通过cDNA克隆序列分析发现的一种新的基因，与细胞胞突形成有关,其编码蛋白为细胞皮质区肌动蛋白结合蛋白(cortical actin binding protein，Cortactin),能通过氨基末端结合并活化肌动蛋白相关蛋白2/3(Arp2/3)复合物，来调节肌动蛋白的动力;而羧基末端则在肌动蛋白多聚化中起关键作用，能显著增强上皮细胞的运动迁移能力,与肿瘤细胞侵袭、转移有关[2]。本实验通过RTPCR法对94例乳腺癌组织及癌旁组织中EMSl mRNA表达情况进行研究，结合乳腺癌分子分型及各项临床病理学检测结果，分析EMSl mRNA表达水平在乳腺癌组织中的临床意义。

　　1 资料与方法

　　1.1 临床资料

　　94例女性乳腺癌为南通大学附属医院普外科2007年2月至2008年1月收治的患者。年龄在24～87岁之间，平均年龄58.4岁，≥50岁者62例，绝经者54例，61例肿块直径≥2 cm。病理分型、组织学分级、淋巴结转移状况等均以术后病理报告为准。患者术前均未进行化疗或放疗,其中行乳腺癌改良根治术79例,根治术13例,扩大根治术2例。术后病理证实腋窝淋巴结转移者给予化疗，腋窝淋巴结转移超过3枚者加做放疗，雌激素受体(estrogen receptor, ER)阳性者给予他莫昔芬口服5年，或者ER阳性且绝经者使用第三代芳香化酶抑制剂进行内分泌治疗。

　　1.2 EMS1 mRNA半定量检测

　　1.2.1 标本收集及处理 94例乳腺癌及癌旁组织标本均在手术时收集，离体后切取新鲜无坏死组织立即投入-196℃液氮速冻，1 h后移至-70℃深冻冰箱中保存备用。

　　1.2.2 总RNA提取 取100 mg组织，采取Trizol一步法提取总RNA，将RNA溶于无RNA酶纯水中,紫外分光光度计定量并鉴定RNA的纯度, RNA电泳判断抽提RNA的质量。

　　1.2.3 RT反应 按照试剂盒说明进行，依次取2 μg总RNA、OligodT(18)(0.5 μg/μl)1 μl、DEPC水补至总体积12 μl,混匀后70℃孵育5 min;依次加入5×反应缓冲液 4 μl、Rnase 抑制剂(20 U/μl) 1 μl、10 mmol/L dNTP 2 μl后，37℃孵育5 min;冰上冷却后，加入MMULV 反转录酶(200 U/μl) 1 μl至20 μl反转录体系,于42℃孵育60 min,70℃孵育10 min，冰上冷却后，-20℃保存。

　　1.2.4 PCR反应 取20 μl反应体系中逆转录产生的cDNA模板2.0 μl，10×PCR 缓冲液5 μl，dNTP(10 mmol/L) 2 μl，Tap酶1.5 U，EMS1及GAPDH引物(上、下游)各1 μl，MgCl2(25 mmol/L)3 μl和灭活Rnase的双蒸水补足体积至50 μl,于PCR扩增仪上经94℃预变性5 min，94℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃复性1 min，30个循环，最后72℃延伸10 min。产品及引物由上海生工有限公司合成提供。EMS1引物参考文献[3]：正义: 5′TCCCAATCCAGAGACCCG3′;反义:5′TCCCCTGATGCCCAGGTC3′,扩增EMS1基因片断，共113 bp。以细胞内表达恒定的人GAPDH作为内参照。根据基因库中GAPDH cDNA序列，由引物设计软件Prime Premier 5.0设计目的基因，扩增片段全长215 bp。引物为正义：5′CCTTCATTGACCTCAACTACATG3′;反义：5′CTTCTCCATGGTGGTGAAGAC3′。

　　1.2.5 PCR产物相对定量分析 取10 μl PCR产物加入2 μl 6×加载缓冲液，经2%琼脂糖凝胶水平电泳，溴化乙啶染色，紫外灯下观测。存入Dolphin1d凝胶成像分析系统，测量电泳带的光密度值。结果判定：PCR产物量以光密度×面积来表达，以目的基因EMS1的PCR产物量与GAPDH产物量的比值代表目的基因的相对表达量。以癌旁组织EMS1 mRNA的相对表达量均值为界限，将癌组织分为EMS1 mRNA高表达和低表达组，计算高表达率。

　　1.3 ER、PR、Her2/neu、EGFR蛋白表达的检测

　　术后常规对乳腺癌组织进行免疫组化分析，采用LAB VISION 2D全自动免疫组化染色仪，ELIVISON二步法进行染色，检测ER、PR、Her2/neu、EGFR的表达。ER、PR蛋白染色颗粒位于胞核内, 阳性结果为胞核呈棕黄色或棕褐色颗粒;Her2/neu染色颗粒位于胞膜，胞膜染色为阳性细胞;EGFR蛋白染色颗粒位于胞质内，阳性结果为胞质内呈棕黄色颗粒。染色半定量分级标准：每张切片选5个高倍视野(200倍)，按肿瘤阳性细胞率和着色强度分别进行计分：① 按阳性细胞百分率，0分为≤5%，1分为6%～25%，2分为26%～50%，3分为51%～75%，4分为>75%;② 按着色计分：分为4个等级，0分为无着色，1分为淡黄色，2分为黄色，3分为棕黄色。两者的乘积：0分为(-)，1～4分为(+)，5～8分为(++)，9～12分为(+++)。统计时，(-)及(+)表达作为阴性组;(++)及(+++)表达作为阳性组。

　　1.4 统计学方法

　　使用SPSS13.0统计软件进行统计分析。计数资料采用Pearson卡方检验，卡方检验有相关性的，行Spearman等级相关分析。方差齐性及多样本均数比较采用F检验，数据用x±s表示。检验水准为0.05。

　　2 结 果

　　2.1 乳腺癌和配对癌旁正常组织中EMS1 mRNA的表达水平

　　乳腺癌及配对癌旁正常组织均表达EMS1，服从正态分布，且方差齐。94例乳腺癌组织中，EMS1 mRNA表达的相对光密度值为0.578±0.105;癌旁组织为0.397±0.079。乳腺癌组织EMS1 mRNA表达均值明显高于癌旁组织，两者比较差异有统计学意义(P<0.01)。但由于癌组织与癌旁组织EMS1 mRNA表达的相对光密度值范围部分重叠，少数癌组织EMS1 mRNA相对光密度值可略低于癌旁组织，如33号标本(图1，T表示肿瘤组织，N为其癌旁正常对照)。以EMS1 mRNA 表达均值0.397为界，将乳腺癌组织EMS1 mRNA表达分为高表达和低表达，本组94例乳腺癌患者中有57例患者高表达，高表达率为60.6%(图2，T19/T27/T52/T68为高表达，T11/T44/T75为低表达)。

　　2.2 EMS1 mRNA表达与乳腺癌临床病理参数的关系

　　EMS1 mRNA高表达与年龄≥50岁、绝经后、腋淋巴结转移成正相关，相关度R分别为0.248，0.275和0.213;而与肿瘤大小、分级水平、TNM分期无关(表1)。　表1 EMS1 mRNA表达与乳腺癌临床病理参数的关系

　　2.3 EMS1 mRNA表达与乳腺癌分子分型的关系

　　免疫组化结果见图3。根据免疫组化结果，运用Perou等[4]和Sorlie 等[5]提出的基因表达聚类分析，将94例乳腺癌组织按分子分型分为5种不同的亚型：luminal A 型，luminal B 型，HER2 过表达型，basallike型和normal breastlike型。分别检测EMS1表达水平(表2)。Luminal A型中EMS1平均表达水平最低，而basallike型中EMS1平均表达水平最高;两者EMS1平均表达水平与其余4型比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。

　　3 讨 论

　　EMS1/Cortactin促进肿瘤转移的具体作用机制，目前尚不十分清楚。Kurebayashi等[6]发现，Cortactin通过加强与内皮细胞的相互作用，促进肿瘤细胞骨转移，可能是Cortactin促进肿瘤细胞侵袭转移的机制之一。有研究表明，Cortactin过表达通过促进Eselectin介导的细胞间黏附连接的形成和细胞骨架表2 EMS1 mRNA表达与乳腺癌分子分型的关系的重组，可能是Cortactin促进肿瘤细胞侵袭与转移的机制之一[7]。EMS1/Cortactin过表达通过细胞外信号调节激酶和/或AKT(蛋白激酶B),提高血清和表皮生长因子介导的细胞增殖,并抑制肿瘤细胞的失巢凋亡[8]。Luo等[9]研究发现，EMS1/Cortactin可能通过PI3 Kinase/Akt信号途径抑制肿瘤细胞的失巢凋亡。

　　腋淋巴结转移是判断乳腺癌患者预后重要的指标，同时也是肿瘤分期及选择治疗方案的重要依据，乳腺癌患者生存率随着阳性淋巴结数目的增多而递减[10-11]。本次研究我们发现，EMS1基因高表达与乳腺癌患者年龄≥50岁、绝经后、腋淋巴结转移正相关。提示在年龄≥50岁和(或)绝经后的乳腺癌患者中，腋淋巴结转移可能与EMS1基因高表达有关。因此，测定EMS1表达状况对判断乳腺癌患者的治疗方式的选择及预后判断可能有指导意义。

　　乳腺癌的分子分型能很好地反映其生物学行为, 明确其个体分子特征, 不仅有助于判断预后, 还有助于预测乳腺癌对临床治疗的反应, 是实现个体化治疗的基础。采用基因芯片技术对乳腺癌进行基因表达谱分析是鉴定各种分子亚型最有效的工具。但该技术对标本的要求较高, 且费用昂贵,实际操作困难, 较难在临床广泛应用;乳腺癌各分子亚型均有蛋白质标志物如ER, PR, HER2, CK5/6, EGFR等的明显差异, 所以大多数研究应用免疫组织化学技术替代基因芯片技术在蛋白质水平上对乳腺癌进行分子分型。虽然乳腺癌的异质性使得免疫组织化学技术的分子分型和基因芯片技术的结果不完全一致，但前者也基本反映了各分子亚型的临床特征，目前被广泛采用。通过对EMS1在本组乳腺癌各分子分型中表达状况的检测，我们发现，luminal A型中EMS1平均表达水平最低;而basallike型中EMS1平均表达水平最高，较其他分子分型有显著差异，提示在basallike型乳腺癌中，EMS1高表达可能是促进该型肿瘤早期复发转移的重要因素之一。

　　合理使用分子靶向药物能显著提高乳腺癌各亚型的治疗效果。luminal A 型HER2-,内分泌治疗效果明显优于luminal B 型, 但对化疗不敏感。luminal B型HER2 +，对他莫昔芬耐药，但对芳香化酶抑制剂敏感。HER2 过表达型ER且PR,故内分泌治疗效果差;但含有蒽环类的化疗方案以及抗HER 2的靶向治疗药物赫赛汀的应用可以显著改善其预后[12-13]。Normal breast like 型对化疗最不敏感，basal like型乳腺癌ER,PR和HER2均为阴性,内分泌治疗和赫赛汀对其均无效。此型虽然对化疗有较高的敏感性, 但在所有分子亚型中其预后仍是最差的，其靶向基因仍不明确，因此寻找新的靶向药物是治疗此型患者的关键。

　　研究发现，ADP核糖基化因子(Arf6)在乳腺癌的侵袭中起关键的作用。AMAP1蛋白是GTPArf6的效应分子，它的表达与浸润性乳腺癌高度相关。AMAP1与Cortactin、桩蛋白结合形成三聚体复合物而发挥作用。在复合物中，AMAP1通过Cortactin的脯氨酸富集区与其SH3区呈1∶2结合。进一步的研究发现，从AMAP1中衍生出的一种细胞渗透性多肽能特异性阻抑Cortactin 与AMAP1结合，从而有效地抑制了乳腺癌细胞的浸润与转移。同时还发现，抑制Cortactin的SH3区与脯氨酸富集区结合的抑制剂UCS15A，能有效阻抑Cortactin 与AMAP1结合，从而抑制乳腺癌细胞的浸润与转移。结合超微结构分析，正常乳腺上皮细胞未发现Cortactin /AMAP1复合物。Cortactin的SH3区很可能是乳腺癌药物治疗的靶位点[14]。因此，我们认为，针对Cortactin SH3区的单克隆抗体对于内分泌治疗及赫赛汀治疗效果不佳的乳腺癌患者，尤其是basal like型乳腺癌，可能是一条新的治疗途径。

　　恶性肿瘤的发生、发展、浸润与转移是多基因多因素共同作用的结果,对肿瘤相关基因的研究有利于阐明其发生、发展及浸润转移的机制，同时为临床早期诊断、综合治疗及预后判断提供依据。目前，对于EMS1/Cortactin的结构、作用以及分子生物学机制尚未完全阐明，需要进一步的研究与完善;其对于临床的诊断、治疗及预后判断，尚需要进一步的大样本量统计分析。

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