石杉碱甲与POCD模型大鼠海马CA1区ChAT表达相关性的研究

　　作者：徐爱丽 丁宝忠 王 华 作者单位：1 滨州医学院生理学教研室 烟台市 264003;2 滨州市人民医院普外科

　　【摘要】 目的 探讨腹部的手术操作对老年大鼠学习认知能力的影响和海马CA1区胆碱乙酰转移酶(ChAT)阳性神经元的变化以及石杉碱甲干预的结果。方法 20月龄Wistar大鼠32只，随机分为对照组(C组)、麻醉组(A组)、手术组(O组)和石杉碱甲组(Hup组)，Hup组手术前给予石杉碱甲灌胃3周，3周后O组与Hup组行脾切除术。术后1、3、7 d进行水迷宫测试，术后7 d取脑使用免疫组织化学法观测海马CA1区ChAT的表达。 结果 术后1 d进行水迷宫测试，与C组比较，A组、O组潜伏期和游泳距离均延长(P<0.05);术后3 d，与C组比较,O组、Hup组潜伏期和游泳距离进一步延长，而Hup组与O组比较,潜伏期和游泳距离均缩短(P<0.05);术后7 d，O组与C组比较,潜伏期和游泳距离延长程度缩小。术后7 d，与C组、Hup组比较,O组的平台象限停滞时间百分比以及在平台象限游泳距离占总游泳距离百分比均减小(P<0.05)。术后7 d，O组海马CA1区ChAT阳性细胞数较C组和Hup组增多(P<0.05)。结论 老年大鼠脾切除术后早期可出现认知功能障碍(POCD),海马CA1区ChAT表达上调, 预先给予石杉碱甲0.15 mg/kg(连续3周)可以改善 POCD模型大鼠学习记忆的功能。

　　【关键词】 石杉碱甲;POCD模型大鼠;海马;胆碱乙酰转移酶

　　Study on the correlation between huperzine A and choline acetyltransferase in CA1region of POCDmodel rat's hippocampus

　　XU Aili1 DING Baozhong2 WANG Hua1

　　1 Department of Physiology,Binzhou Medical University,Yantai 264003;2 People's Hospltal of Binzhou

　　【Abstract】 Objective To evaluate the effect of abdominal surgery on the learning and cognitive ability in aged rats and the change of choline acetyltransferase(ChAT) neurons in CA1 region in hippocampus and the result of the intervention of huperzine A.Methods 32 Wistar aged rats were randomly divided into control group (C,n=8), anesthesia group (A,n=8), operation group (O,n=8) and huperzine A group (Hup,n=8), the Hup group were administered huperzine A for three weeks before operation, after three weeks group O and group Hup received splenectomy. Morris water maze test was performed on the 1st, 3 rd and 7 th day after operation, the animals were killed in 1 h after the last test and the brains were immediately removed for determination of ChAT expression in CA1 region in hippocampus using immunohistochemistry.Results Morris water maze test was performed on the 1st day after operation, compared with group C, the latency period and swimming distance of groups A and C both extended (P<0.05).On the 3 rd day after operation, compared with group C, the latency period and swimming distance of group O, group Hup extended further, while compared with group O,the latency period and swimming distance of group Hup shortened (P<0.05);Compared with group C, the extending degree of the latency period and swimming distance of group O decreased on the 7 th day after operation. Compared with group C and group Hup, both of the mean percentage of time and distance of group O spent swimming in the quadrant with platform shortened (P<0.05).Compared with groups C and Hup, the quantities of ChAT neurons in CA1 region in hippocampus of group O increased on the 7 th day after operation(P<0.05),while the quantities of ChAT neurons in CA1 region in hippocampus of group C were equal to that of group Hup. Conclusion Cognitive impairment appeared in the early stage after splenectomy on aged rats,ChAT expression in CA1 region in hippocampus upregulated, administering huperzine A 0.15 mg/kg for three consecutive weeks before operation can improve the cognitive ability of rats which suffered postoperative cognitive dysfunction(POCD).

　　【Key words】 huperzine A,postoperative cognitive dysfunction，hippocampal,choline acetyltransferase

　　术后认知功能障碍(POCD)现在临床上广泛关注，老年人由于机体退行性变导致术后早期POCD的发生率大大增加，但其发生机制不甚清楚。脑内胆碱能系统在高级动物的学习记忆中起着重要作用[1]，但在POCD发生机制中的作用并不清楚。我们选择反映应胆碱能神经的胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransferase, ChAT)作为观察指标，旨在研究其与POCD发生发展的关系，探讨POCD的发生机制。另一方面，目前对POCD预防和治疗的有效性研究较少，为探讨对POCD的治疗策略，我们对脾切除术后大鼠认知障碍进行药物干预研究。以往研究表明石杉碱甲(huperzine A,Hup A)具有很好的抗衰老和改善学习记忆功能作用[2]，本文以神经生理学和组织细胞学两方面研究该药对脾切除术后大鼠认知障碍的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 药物与试剂 石杉碱甲(河南竹林众生制药公司)，氯胺酮(福建古田药业公司),山羊抗胆碱乙酰转移酶多克隆抗体(Goat AntiChAT,chemicon )。

　　1.2 动物分组及模型制备 20月龄雄性Wistar大鼠(甘肃中医学院实验动物中心提供)经筛选剔除体重过大或过轻及在水中不游动的，共选出动物32只，体重500～550 g。按体重分级，随机分成四组。对照组(control group ,C组，n=8),麻醉组(anesthesia group ,A组,n=8),手术组(operation group ,O组，n=8)，石杉碱甲组(huperzine A group ,Hup组，n=8)。其中Hup组给石杉碱甲灌胃，0.15 mg·kg-1·d-1，溶于生理盐水中，连续灌3周[4]，C组、A组、O组均按体重给与同容量的生理盐水灌胃3周，3周后O组和Hup组在氯胺酮腹腔注射(25 mg/kg)麻醉下行脾切除手术;A组仅给与氯胺酮麻醉，不行手术;C组仅腹腔注射同容量的生理盐水。

　　1.3 学习、记忆功能的行为学测试 通过Morris 水迷宫测试,将圆池内壁和平台漆成黑色点,通过自动图像拍摄系统记录游泳轨迹, 入水至找到平台为潜伏期,其总行程为游泳距离[3]。术前学习5 d,每天测试4次,取其平均值,术后1、3、7 d分别进行测试，并于术后7 d撤掉平台，记录60 s内大鼠在每个象限的停滞时间和在每个象限游泳的距离。

　　1.4 免疫组化染色

　　1.4.1 灌注和切片:大鼠行为学观察结束后，氯胺酮(25 mg/kg)腹腔麻醉动物,暴露心脏,先以0.9%生理盐水经升主动脉灌注冲洗后,灌注4%多聚甲醛溶液(pH=7.4)900 ml,持续2 h后取脑, 将脑置于20%蔗糖的PBS溶液中浸置24～48 h (4℃),冰冻冠状连续切片(厚度30 μm),海马组织每5张取1张。

　　1.4.2 免疫组化染色步骤:切片置于0.3 %Triton中浸30 min, PBS液洗3次,每次15 min;在稀释浓度为1∶2 000的山羊抗ChAT多克隆抗体中孵育72 h(4℃); PBS液漂洗后在生物素标记二抗(1∶100)中,室温下孵育1 h;辣根过氧化物酶标记链霉卵白素(1∶100)中,室温下孵育1 h;二氨基联苯氨(DAB)反应液中成色,室温下10～20 min;常规明胶裱片、脱水、DPX封片。为了计算ChAT细胞数目，采用标准网格的技术方法，在100倍的光镜下做ChAT细胞计数，以“500 μm×400 μm”为单位,结果取3个视野的平均值。

　　1.5 统计方法 计量资料用均数±标准差(x±s)表示。用SPSS12.0统计软件分析，组间比较采用重复测量的单因素方差分析,P<0.05有统计学差异。

　　2 结果

　　2.1 水迷宫测试结果 见表1～3。术后1 d A组、O组的逃避潜伏期和游泳距离延长，与对照组相比均有统计学意义(P<0.05);术后3 d仅O组，Hup组与对照组比较有统计学意义(P<0.05)，且数值达高峰;术后7 d O组与对照组比较有差异(P<0.05),但差距已明显缩小;术后Hup组与O组比较均有差异(P<0.05)。见表1，Hup组术前的逃避潜伏期和游泳路程较对照组有明显差异(P<0.05)。见表3，与C组、Hup组比较，术后7 d在60 s内O组的平台象限停滞时间百分比减小(P<0.05)，与C组、Hup组比较，术后7 d在60 s内O组的平台象限游泳距离占总游泳距离百分比减小(P<0.05)。这些结果说明脾切除术后大鼠在水迷宫测试中的空间认知能力受到损害，单次使用氯胺酮仅引起极短期的认知减退，而石杉碱甲组减弱了脾切除术后大鼠在水迷宫测试中学习记忆能力的损害。表1 各组大鼠的逃避潜伏时间用重复测量设计资料的协方差分析，术前作为协变量，结果表明：逃避潜伏时间Hup组与对照组比较有差异(P<0.05)，Hup组与手术组比较有差异(P<0.05)。表2 各组大鼠的游泳路程表3 术后7 d各组大鼠在60 s内平台象限停滞时间和游泳距离百分比

　　2.2 免疫组织化学结果 图1，图2所示为术后7d水迷宫测试后，光镜下海马CA1区C组和O组的ChAT免疫反应阳性神经元的结果。见图3，以“500 μm×400 μm”为单位，海马CA1区C组、O组和Hup组的ChAT免疫反应阳性神经细胞表达率分别是(68.17±3.02)、(80.15±2.18)和(70.31±2.56)，O组海马CA1区ChAT阳性细胞数较C组、A组和Hup组都增多(P<0.05),而C组、A组和Hup组的ChAT阳性细胞数相当。

　　3 讨论

　　大量的临床资料显示，部分老年患者经历麻醉手术后可发生认知功能障碍，表现为轻重不等的记忆力、判断力、抽象思维、智能、定向力等障碍，同时伴有社会活动能力的减退，称为术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunction,POCD)。因此，老年人麻醉术后认知功能障碍已为人们广泛关注。Moller对1 218例60岁以上的老年患者进行了POCD的调查研究 [4]，发现25.8%的患者在术后1周出现了POCD，术后3个月9.9%的患者出现POCD，而相近年龄对照组患者的发生率分别为3.4%和2.8% , POCD对大多数患者来说是可逆的，但仍有少数患者存在长期甚至永久的认知功能障碍[5]。

　　脾切除手术对大鼠的机体影响较小，术后大鼠可以如期进行水迷宫测试。术前水迷宫测试成绩Hup组明显好于其他组，说明石杉碱甲可以改善大鼠的认知功能，与以往的文献报道相符[4]。术后1 d，A组、O组空间记忆力低于对照组，Hup组不低于对照组，但呈下降趋势,表明手术组学习记忆功能下降;术后3 d，A组记忆力恢复，O组、Hup组进一步减退，Hup组也低于对照组，但Hup组与O组有统计学差异, 提示石杉碱甲具有改善POCD模型大鼠学习记忆的功能;术后7 d，仅O组与对照组的差异明显缩小,提示老年大鼠的学习记忆能力正在恢复。A组单纯应用氯胺酮，记忆力仅术后1 d较低，以后恢复。文献报道反复应用小剂量氯胺酮可引起认知功能障碍[5]，单次使用可能仅引起极短期的认知减退。

　　研究表明中枢胆碱能神经系统在学习和记忆功能中起主要作用，分布于海马结构中的胆碱能纤维与学习和记忆密切相关[6]，许多年龄相关的认知障碍都有海马胆碱能系统活力下降,ChAT是中枢神经系统合成乙酰胆碱(Ach)过程中重要的酶,研究中采用免疫组化技术观测了海马CA1区ChAT的变化,结果发现POCD模型大鼠海马CA1区ChAT阳性细胞数目增多,而研究表明海马ChAT 阳性神经元减少与大鼠痴呆发生密切相关[7]。造成此结果有两种可能因素，一是由于机体为防止轻度认知功能障碍加重并转化为永久性痴呆而导致海马CA1区ChAT活性上调[8];另一种因素，可能是POCD大鼠的胆碱能神经进行了代偿性机能上调，但这种变化与认知功能的具体关系机制还有待进一步研究。

　　石杉碱甲是从蛇足石杉中分离得到的一种新生物碱,是一种高效可逆的胆碱酯酶抑制剂,其改善、促进学习、记忆过程的作用已有定论[2]。多种针对动物实验性记忆障碍模型的研究结果表明，石杉碱甲对成年、老年啮齿类动物及老年猴有促智作用，石杉碱甲改善学习、记忆的作用呈典型的钟形量效关系，剂量过大则损害记忆功能。给予石杉碱甲0.01～0.50 mg/(kg·d)，均能明显增强实验动物的学习、记忆功能。因此选择石杉碱甲灌胃，0.15 mg/(kg·d),为确保疗效连续用药3周[9]。

　　Ach是脑内广泛分布的重要神经递质,主要参与记忆与认知功能。老年大鼠的皮层胆碱能神经网络密度降低,在非病理性老化中都不同程度存在脑中Ach生成和释放的减少,因此全麻手术后早期谵妄好发于老年大鼠。本实验结果提示石杉碱甲的干预稳定了海马胆碱能系统,改善了POCD模型大鼠的学习记忆的功能。

　　综上所述，老年大鼠脾切除手术后早期可发生认知功能障碍，并在术后3 d左右达高峰，以后逐渐恢复, 单次使用氯胺酮仅引起极短期的认知减退，预先给予石杉碱甲能够减轻大鼠学习记忆能力的损害。

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