结肠癌患者转录因子Snail mRNA和蛋白的表达及临床意义

　　作者：陆洪军 王淑秋 刘振平 任翊华 作者单位：佳木斯大学第一附属医院普通外科，黑龙江 佳木斯 154002

　　【摘要】目的 探讨转录因子Snail mRNA和蛋白在结肠癌中的表达及临床意义。方法 分别采用RTPCR和Western印迹方法对68例结肠癌和20例正常结肠黏膜上皮组织进行Snail mRNA及其蛋白检测，分析该转录因子与结肠癌临床病理因素(年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位、组织学分型、浸润深度、分化程度、淋巴结转移、Dukes分期)的关系。结果 在黏液癌(印戒细胞癌、黏液腺癌)、低分化、浸及浆膜、有淋巴结转移及处于Dukes C+D期的结肠癌中，Snail mRNA及其蛋白表达明显增高(P<0.001或<0.05)，但与性别、年龄、肿瘤部位及大小无关(P>0.05)。结论 Snail的表达与结肠癌侵袭、转移密切相关;检测Snail mRNA及其蛋白对大肠癌的诊疗有一定价值。

　　【关键词】 结肠癌;Snail;侵袭;转移

　　在肿瘤的生物学行为中，浸润和转移是最重要的特征，也是一些实质性肿瘤难以治愈的原因。尽管外科手术治疗、放射治疗和化学治疗日益完善，但如何早期诊断，及时正确治疗，抑制恶性肿瘤浸润和转移，提高患者的生存率已成为当今肿瘤防治的重要课题。研究证实，上皮间充质转化(epithelialmesenchymal transition，EMT) 是包括结肠癌在内的许多肿瘤细胞获得侵袭、转移能力的重要机制。转录因子Snail通过与Ecadherin启动子区的E盒(Ebox)结合，下调Ecadherin的表达，进而诱导EMT的发生，促使肿瘤细胞侵袭转移〔1〕。本文旨在探讨转录因子Snail在结肠癌中的表达，以判定该转录因子在结肠癌侵袭、转移中的作用。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象

　　2007年1月至2008年8月，在本院行根治性手术的大肠癌患者68例，男42例，女26例;年龄32～75岁(中位年龄57.3岁);术中留取标本。所有病例术前均未接受化疗及放疗。①肿瘤部位：左半结肠38例、右半结肠30例;②肿瘤大小：≤5 cm者48例、>5 cm者20例。③组织学分型：乳头状腺癌4例，管状腺癌48例，黏液腺癌11例，印戒细胞癌5例;④分化程度：高分化腺癌24例，中分化腺癌30例，低分化腺癌14例;⑤浸润深度：未及浆膜层25例，浸及浆膜层43例;⑥淋巴结转移：有转移18例，无转移50例;⑦Dukes分期：A期32例，B期20例，C期11例，D期5例。另取20例结肠癌正常肠段的肠黏膜(经病理检查无异常)作对照。

　　所用试剂为兔抗人Snail多克隆抗体(购自Santa Cruz公司);逆转录酶试剂盒(购自Promega公司);Trizol试剂(购自美国宝生公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 Snail mRNA检测

　　按Trizol试剂盒说明提取总RNA。用紫外分光光度仪测定A260/A280，比值在1.9～2.0之间，计算RNA含量。引物设计：(1)上游引物：5′AATCGGAAGCCTAACTACAG3′;下游引物：5′GGAACAGGCTGAAGTAGAG3′(扩增长度320 bp)。(2)GAPDH：上游引物：5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′;下游引物：5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′ (扩增长度452 bp，为内参照)。逆转录反应按试剂盒操作。RTPCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离检测。

　　1.2.2 Snail 蛋白的检测

　　Western印迹法。总蛋白提取：4℃收集细胞，每孔加入100 μl细胞裂解液(50 mmol/L TrisHCl、150 mmol/L NaCl、5 mmol/L pH8.0 EDTA、1% NP40、0.05% PMSF、2 μg/ml Aprotinin、0.5 μg/ml Leupeptin)，超声破碎，4℃ 12 000 r/min离心5 min，收集上清液。细胞核蛋白提取：参照文献方法〔2，3〕，略改动。蛋白质样品与等体积2×上样buffer混匀，煮沸5 min，紫外分光光度计测定蛋白质浓度。按蛋白含量测定结果每孔上样50 μg，12.5% SDSPAGE分离样品。低温100 V3 h将蛋白转至硝酸纤维膜上，用封闭液(5%脱脂奶粉、3%BSA、0.02% Tween20溶于PBS)室温封闭2 h，将膜与溶于封闭液中的一抗(兔抗人Snail多克隆抗体1∶500)室温孵育2 h，PBS洗5 min×3次，TBS洗5 min×4次，将膜与溶于二抗稀释液(5%脱脂奶粉、0.02% Tween20、150 mmol/L NaCl、50 mmol/L TrisHCl，pH7.5)中的二抗室温孵育1 h，TBS洗5 min×4次，将膜装入可热接封的塑料袋中，加入ECL试剂，暗室曝光、显影、定影，对X光底片拍照保存。

　　1.3 统计学处理

　　所有数据均采用x±s表示，应用SPSS13.0统计软件对数据进行分析。各组Snail mRNA相对水平经方差齐性检验后采用Studentt检验。

　　2 结 果

　　2.1 结肠癌组织Snail mRNA表达与临床病理因素的关系

　　Snail mRNA在结肠癌中的表达水平与性别、年龄、肿瘤部位及大小无关(P>0.05)，而与肿瘤浸润深度、组织学分型、分化程度、淋巴结转移及Dukes分期均有关。Snail mRNA在黏液癌(印戒细胞癌、黏液腺癌)、低分化、浸及浆膜、有淋巴结转移及处于Dukes C+D期的结肠癌组织中表达均明显增高(P<0.05，P<0.001)。Snail与结肠癌肿瘤细胞的侵袭、转移密切相关。见表1。表1 结肠癌组织Snail mRNA表达指数与临床病理因素间的关系(略)

　　2.2 结肠癌和癌旁组织Snail mRNA及其蛋白的表达

　　结肠癌组织与癌旁正常肠黏膜组织中均有Snail mRNA表达，但与正常结肠上皮相比较，结肠癌Snail mRNA的表达升高(P<0.01)。见表2和图1。结肠癌Snail P30条带较正常对照组加宽加深，应用Chen Image 5500v2.03软件计算蛋白平均灰度值，结果显示Snail蛋白表达与正常结肠上皮相比较，有显著差异(P<0.001)。见表2和图2。表2 结肠癌和癌旁正常肠黏膜组织中Snail mRNA及其蛋白的表达(略)

　　3 讨 论

　　EMT是指上皮细胞在特定的生理和病理条件下向间充质细胞转化的现象，是许多肿瘤细胞获得侵袭、转移能力的重要机制〔4〕。EMT在个体胚胎发育、组织形成、伤口愈合和慢性炎症中，均发挥着重要作用〔5〕。研究证实，Snail参与了包括乳腺癌、胃癌和鳞状上皮细胞癌在内的某些肿瘤细胞发生EMT并促进其侵袭转移〔6～8〕。Snail可使细胞E钙黏素及α、β、γ连环素等上皮细胞标志物表达降低或消失，可表达成纤维细胞特异性蛋白1、N连环素等多种间充质细胞标志蛋白，且可增强肿瘤细胞侵袭和转移能力。在一定条件下逆转EMT表型时，就可以降低肿瘤细胞的侵袭转移能力并延长荷瘤动物的生存期。

　　Snail通过以下机制引起肿瘤侵袭转移：① 作用于启动子上的Eboxes连接基序，直接抑制Ecadherin、claudins、occludins等上皮黏附位点成分的转录，使细胞间黏附紊乱;② 抑制ABLIMl、EPLIN等细胞骨架成分表达，使细胞骨架重组;③ 促进基质金属蛋白酶表达，降解基质以促进细胞侵袭。研究证实，Snail引起的EMT在肿瘤转移过程中发挥重要作用，但不是惟一的，免疫抑制也起着一定作用〔9〕。

　　本研究表明：(1)结肠癌组织和癌旁正常组织Snail mRNA及其蛋白表达间存在差异：结肠癌组织Snail mRNA及其蛋白表达增加，提示Snail的高表达是结肠癌的发生、发展过程中的重要事件。(2)Snail mRNA及其蛋白的表达与组织学类型、分化程度、浸润深度、有无淋巴结转移、Dukes分期均有关：在黏液癌、低分化、侵及浆膜、有淋巴结转移和处于Dukes C+D期的结肠癌中Snail mRNA及其蛋白表达明显升高，同样提示Snail的表达增加可以评价结肠癌的浸润、转移。

　　【参考文献】

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　　8 Usami Y，Satake S，Nakayama F,et al.Snailassociated epithelialmesenchymal transition promotes oesophageal squamous cell carcinoma mortality and progression〔J〕.J Pathol，2008;215(3)：3309.

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