靶向survivin基因siRNA在食管癌细胞增殖和凋亡中作用的研究

　　作者：王雁 张静静 孙为豪 作者单位：210029江苏省南京市，南京医科大学第一附属医院老年科(王雁，孙为豪);普外科(张静静)

　　【摘要】 目的 研究survivin基因特异性RNA干扰对食管癌Eca109细胞株体外增殖能力和凋亡的影响。 方法 构建靶向survivin的小干扰RNA(siRNA)表达载体，用脂质体法转染Eca109细胞后，采用半定量RTPCR、Western Blot检测转染前后survivin mRNA及蛋白表达水平的改变，采用噻唑兰(MTT)法检测细胞的生长增殖情况，采用流式细胞术测定细胞的凋亡情况。 结果 靶向survivin的序列特异性的siRNA可以有效地抑制Eca109细胞survivin基因的表达。转染靶向survivin的siRNA表达质粒可以显著抑制Eca109细胞的增殖(细胞接种24 h、48 h后增殖抑制率分别为21.05%和33.96%)，诱导明显的细胞凋亡[转染24 h、48 h后的凋亡率分别为(8.03±1.05)%和(6.22±1.06)%]。 结论 survivin基因特异性RNA干扰可以显著抑制食管癌Eca109细胞的体外增殖并诱导明显的细胞凋亡。

　　【关键词】 survivin; RNA干扰; 食管癌; 基因表达; 细胞增殖; 细胞凋亡

　　Study of the effect of siRNA targeted against survivin on cell proliferation and apoptosis of esophageal cancer cells WANG Yan， SUN Weihao. Department of Geriatrics; ZHANG Jingjing. Department of General Surgery; the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China【Abstract】　Objective To investigate the effect of siRNA targeted against survivin on cell proliferation and apoptosis of Eca109 esophageal cancer cells. Methods A siRNA plasmid expression vector against survivin was constructed and transfected into Eca109 cells with LipofectamineTM2000. The changes of survivin mRNA and protein expression were detected by semiquantitive RTPCR and Western Blot. Cell proliferation was detected by MTT assay. Cell apoptosis was evaluated by flow cytometry. Results The sequencespecific siRNA effectively suppressed survivin expressing at both mRNA and protein levels. Survivin expression surpression significantly inhibited the proliferation (at 24 h and 48 h after cell seeding, the proliferation inhibition rate was 21.05% and 33.96% respectively) and induced apoptosis of Eca109 cells (at 24 h and 48 h after transfection, apoptosis rate was (8.03±1.05)% and (6.22±1.06)% respectively. Conclusions siRNA targeted against survivin can effectively suppress Eca109 cell proliferation and significantly induce Eca109 cell apoptosis.

　　【Key　words】 survivin; RNA interference; esophageal cancer; gene expression; proliferation; apoptosis

　　survivin基因是于1997年发现的凋亡抑制蛋白(IAP)家族的最小成员[1]，其广泛表达于人类各种肿瘤，具有抑制细胞凋亡、参与细胞周期调节和促进血管形成等功能[2]。食管癌是我国常见的恶性肿瘤之一，中、晚期食管癌术后5年生存率仅为10%左右，预后极差[34]。很多研究已经证实食管癌中survivin基因高表达[56]，所以survivin有望成为食管癌基因治疗的一个新的有效靶点。RNA干扰(RNAi)是双链RNA 介导的转录后基因沉默，具有高度的特异性和有效性，正成为基因功能研究的有力工具[78]。因此我们构建了靶向survivin基因的小干扰RNA(siRNA)表达质粒并转染食管癌细胞Eca109，观察其在食管癌细胞增殖和凋亡中的作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 人食管癌Eca109细胞购于上海细胞所;RPMI 1640培养基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、双抗(青、链霉素)购自Gibco公司;Pgenesil1质粒购自武汉晶赛生物工程技术有限公司;MTT、DMSO、LipofectamineTM2000Reagent及Trizol购自Invitrogen公司;BamHⅠ、HindⅢ内切酶购自NEB公司;T4DNA连接酶、PCR试剂盒购于TaKaRa公司;AMLV反转录试剂盒购自Promega公司;引物DNA由上海英骏生物技术有限公司合成;质粒抽提试剂盒购自QINGEN公司;Survivin和βactin抗体购自Cell Signalling公司;ECL化学发光检测试剂盒购自安玛西亚公司;Annexin VFITC细胞凋亡检测试剂盒购自上海凯基生物技术有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养:人食管癌Eca109细胞培养于含10%FBS、2 mmol/L L谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基中，置于37℃、5% CO2潮湿空气的CO2培养箱内培养，待细胞融合率为70%左右时，以0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA消化、传代。

　　1.2.2 靶向survivin的siRNA表达质粒的构建:针对目的基因survivin的序列(5’GGACCACCGCATCTCTACA3’)[9]，合成2条DNA链：5’GATCCGGACCACCGCATCTCTACATTCAAGACGTGTAGA GATGCGGTGGTCCTTTTTTA3’，和3’GCCTGGTGGCGTAGAGATGTAAGTTCTGCACATCTCTACGCCACCAGGAAAAAATTCGA5’。DNA链的结构为：BamHⅠ+正义链+环状结构+反义链+终止信号+ HindⅢ。上述2条链退火并磷酸化后与线性化载体Pgenesil1(经BamHⅠ、HindⅢ双酶切)进行连接、转化、挑克隆、菌落PCR鉴定及测序验证，命名为：Pgenesilsurvivin(+);同法构建阴性对照质粒，命名为：Pgenesilsurvivin(-)，其靶序列为：5’GACTTCATAAGGCGCATGC3’[10]，2条DNA链序列为：5’GATCCGACTTCATAAGGCGCATGCTTCAAGACG GCATGCGCCTTATGAAGTCTTTTTTA3’，和3’GCTGAAGTATTCCGCGTACG AAGTTCTGCCGTACGCGGAATACTTCAGAAAAAATTCGA5’， 其结构为：BamHⅠ+正义链+环状结构+反义链+终止信号HindⅢ。两质粒分别大量提取后备用。

　　1.2.3 细胞转染:以12孔细胞培养板转染为例，将干扰质粒Pgenesilsurvivin(+)及对照质粒Pgenesilsurvivin(-)分别转染Eca109细胞，具体方法如下：12孔培养板中培养的Eca109细胞生长至90%～95%融合度时进行转染，按Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书，将1.6 μg质粒用无血清1640培养基稀释，脂质体用无血清1640培养基稀释后室温下静置5 min，将脂质体与质粒DNA混匀，室温下再次静置20 min。将上述细胞的培养液更换为新鲜培养液后加入配制完毕的转染混合液轻轻混匀。37 ℃二氧化碳培养箱培养48 h。

　　1.2.4 半定量逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测干扰后survivin mRNA表达水平:细胞接种于6 cm培养板，实验分为3组：空白对照组(未转染质粒，只加脂质体)、阴性对照组[转染Pgenesilsurvivin(-)]及实验组[转染Pgenesilsurvivin(+)]。转染48 h后按照Trizol试剂的说明书提取总RNA。用AMLV反转录试剂盒进行反转录合成cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增，扩增survivin的引物对为：5’GCATGGGTGCCCCGACGTTG3’和5’CTCCGGCCAGAGGCCTCAA3’，扩增产物大小为446 bp;扩增内参GAPDH的引物对为：5’CGAAGTCAACGGATTTGGTCGTA3’和5’GCCTTCTCGGTGGTGAAGAC3’，扩增产物大小为305 bp。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，采用凝胶成像仪拍照记录，实验至少重复3次。

　　1.2.5 Western Blot检测干扰后survivin蛋白表达水平:将细胞接种于6 cm培养板并进行转染，分组同1.2.4。转染48 h后提取细胞总蛋白，具体方法如下：收集细胞，加入300 μl三去污细胞裂解液裂解细胞提取细胞总蛋白，蛋白定量后加1 ×SDS 上样缓冲液，样本于沸水浴5 min，取20 μg进行SDSPAGE电泳，而后将蛋白质转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，加入1∶1000 survivin和βactin单抗，4 ℃孵育过夜(12～16 h)，TBST 洗涤，加二抗(1∶5000) 室温孵育1 h，TBST洗2次，TBS洗1次，然后用ECL化学发光试剂于暗室自显影，用凝胶成像仪拍照记录，实验至少重复3次。

　　1.2.6 MTT法检测细胞增殖抑制率:将细胞接种于6 cm培养板并进行转染，分组同1.2.4。24 h后消化、收集细胞，调整细胞浓度为1×104/ml，分别将各组细胞接种于96孔培养板，每组8孔，每孔200 μl。另设空白对照孔(只加培养液)调零，每个检测时间点接种1板，共3板。于0 h、24 h、48 h时检测Eca109细胞的增殖抑制率：抑制率=(1-实验组A490值/对照组A490值)×100%，A490为490 nm处的吸光度值。

　　1.2.7 流式细胞术测定细胞凋亡率:采用Annexin VFITC凋亡检测试剂盒检测Eca109细胞凋亡。将细胞接种于6孔培养板并进行转染，分组同1.2.4，每组6孔。分别于转染24 h、48 h消化收集细胞，每次每组各取3孔细胞。冷PBS洗涤2次，收集细胞，重悬于100 μl标记液中[HEPES Buffer(HEPES/NaOH，pH7.4;140 mmol/L NaCl2;5 mmol/L CaCl2 ) 含2 μl Annexin V和2 μl PI]，室温避光放置30 min，HEPES洗涤2遍后上机检测。

　　1.2.8 统计学处理:实验数据以平均值±标准差表示，应用SPSS软件进行单因素方差分析，并采用q检验进行组间数据的两两比较。P<0.05为差异具有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 靶向survivin的siRNA表达质粒的测序鉴定结果 将Pgenesilsurvivin(+)质粒的转化菌液送至上海英骏生物技术有限公司测序，测序结果完全正确。

　　2.2 半定量RTPCR检测干扰后survivin mRNA表达水平改变 转染48 h后，RTPCR检测空白对照组、阴性对照组及实验组的survivin mRNA表达水平，电泳后经凝胶成像仪拍照及灰度分析结果表明：与空白对照组相比，转染Pgenesilsurvivin(-)质粒对Eca109细胞survivin mRNA水平无显著影响(P>0.05)，而转染Pgenesilsurvivin(+)质粒显著抑制Eca109细胞survivin mRNA水平(P<0.05)(图1)。

　　1：空白对照组;2：阴性对照组;3：实验组;M：Marker

　　图1 半定量RTPCR检测干扰后survivin mRNA表达水平改变的凝胶电泳图(略)

　　2.3 Western Blot检测干扰后survivin蛋白表达水平改变 转染48 h后，Western Blot检测空白对照组、阴性对照组及实验组的Survivi蛋白表达水平，ECL显色曝光后经凝胶成像仪拍照及灰度分析结果表明：与空白对照组相比，转染Pgenesilsurvivin(-)质粒对Eca109细胞survivin蛋白水平无显著影响(P>0.05)，而转染Pgenesilsurvivin(+)质粒显著抑制Eca109细胞中survivin蛋白水平(P<0.05)(图2)。

　　1：空白对照组;2：阴性对照组;3：实验组

　　图2 Western Blot检测干扰后survivin蛋白表达水平改变(略)

　　2.4 MTT法检测survivin基因RNAi对食管癌细胞的增殖抑制作用 MTT法检测结果表明：转染Pgenesilsurvivin(-)质粒对Eca109细胞的增殖无影响(P>0.05);而转染Pgenesilsurvivin(+)质粒后可显著抑制Eca109细胞的增殖(P<0.05)，转染Pgenesilsurvivin(+)质粒后24 h、48 h的细胞增殖抑制率(与阴性对照组相比)分别为21.05%和33.96%，差异具有统计学意义(P<0.05)(图3)。

　　图3 MTT法检测survivin基因RNAi对食管癌细胞的增殖抑制作用(略)

　　2.5 流式细胞术检测Eca109细胞凋亡 转染24 h、48 h后，空白对照组未检测到明显的细胞凋亡，转染Pgenesilsurvivin(-)质粒组24 h、48 h的凋亡率分别为：(1.37±0.39)%和(1.17±0.11)%;转染Pgenesilsurvivin(+)质粒组检测到明显的细胞凋亡，转染24 h、48 h后的凋亡率分别为(8.03±1.05)%和(6.22±1.06)%(与阴性对照组相比P<0.05)(表1)。

　　表1 流式细胞术检测Eca109细胞凋亡率(略)

　　注：与空白对照组比较，*P<0.05;与阴性对照组比较，△P<0.05

　　3 讨论

　　近年来的研究证实survivin与恶性肿瘤的关系密切，survivin在几乎所有的人类肿瘤中高表达, 而在正常终末分化的成年组织或细胞中不表达[911]。survivin与肿瘤的发生、发展、血管形成、肿瘤的化疗放疗敏感性以及复发、预后等密切相关，阻断survivin基因的表达，可以诱导肿瘤细胞的凋亡，提高肿瘤细胞对化疗药物和放疗的敏感性，抑制肿瘤血管形成[12]。对survivin与食管癌关系的研究表明，survivin在食管癌中存在着过表达，并通过抑制细胞凋亡参与食管癌的发生、发展[56]。这些研究提示survivin有望成为食管癌基因治疗中的有效靶点。

　　RNAi是一种由双链RNA介导的序列特异性的转录后基因沉默过程[78]。自发现以来，siRNA已广泛应用于基因功能、肿瘤和病毒性疾病治疗等的研究。本实验中，我们构建了靶向survivin的siRNA表达载体，其转录产物可在细胞内形成由一个茎环结构所分离的具有反向重复序列的发夹样RNA，此RNA随后被加工成siRNA从而降解靶基因的mRNA，达到阻断靶基因表达的目的。

　　本研究中我们构建了靶向survivin基因的siRNA表达质粒并转染食管癌细胞Eca109，通过半定量RTPCR及Western Blot检测结果表明，所构建的靶向survivin的siRNA表达载体具有高度的特异性，可有效地抑制Eca109细胞中survivin基因mRNA及蛋白的表达;抑制Eca109细胞survivin基因的表达可以显著抑制细胞的增殖并诱导明显的细胞凋亡。本研究结果不但证实了survivin通过抑制细胞凋亡参与食管癌的发生、发展[56]，而且提示了靶向survivin的siRNA在食管癌的治疗中可能具有一定的价值。

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