大肠杆菌sRNA的研究进展

　　作者：王晨红 李春更 李洪涛 作者单位：(1.河北北方学院医学技术学院微生物教研室，河北 张家口 075000;2.河北省唐山市中医院肛肠外科，河北 唐山 063000;3.天津泰达医院，天津 300000)

　　【关键词】 大肠杆菌;RNA/未翻译;研究方法

　　sRNAs即small RNAs或非编码RNAs(noncoding RNAs)是一类长度在几十至几百个核苷酸之间，执行多种功能的非编码RNA[1]。sRNA分子最初是在细菌体内发现的，现已知广泛存在于从原核生物的细菌到高等的哺乳动物等多种不同的生物体内，主要对基因表达起调控作用。本文主要以原核生物大肠杆菌为例，就其sRNA的发现、功能、可能的作用机制及探求新sRNA的方法和Hbq蛋白在sRNA执行功能时的作用作一综述。

　　1 sRNA的发现

　　1967年，通过对大肠杆菌体内所有的RNA进行标记，在聚丙烯酰胺凝胶上探测到一种数量较多的新RNA分子，从而使大肠杆菌的第一个sRNA6SRNA[2]被发现，随后又相继发现了11个sRNA，其中RprA，MicF，DicF，和DsrA是作为基因片段被发现的;GcvB和OxyS是探查基因时偶然发现的，而Spot42，10Sa(tmRNA)和10Sb等是通过磷酸化标记所有的RNA后被发现的(现在被称为M1，是RNA酶P的RNA元件)[37]。但是他们的生理功能直到30年后才被阐明。原核生物的sRNA长度一般在50～250nt之间，长于真核生物中成熟的miRNA，它们在细胞中通常不被翻译，而是作为重要的调控因子参与原核生物基因的转录和翻译调控及其RNA的稳定、成熟和加工等多个过程。

　　2 识别sRNA的方法

　　由于sRNA通过实验性探查或传统序列分析的方法很难检测到，因此尽管我们已知这些RNA分子对生物体的生理功能具有重要作用，但实际上许多的sRNA分子都是在研究个别基因系统时被偶然发现的[8]。近年来随着systematic computational，microarray和cloningbased新技术的应用，新的sRNA分子不断被发现，至今在大肠杆菌体内已发现了超过百余种的sRNA分子[9]。

　　2.1 systematic computational法

　　大肠杆菌完整基因序列的获得，使得通过系统搜寻在其基因序列中寻找sRNA的编码基因成为可能[10]。由于sRNA不翻译且仅依据二级结构就将非编码的RNA分子从随机序列中分离出来不够精确，因此采用computational法识别sRNA时要参考一些已知的sRNA基因序列特征。通过对已知sRNA分子编码基因序列分析发现，sRNA分子的基因位点主要存在于称为“empty”的基因间区，此位点没有其他

　　的注释基因。此外sRNA分子的基因序列与有亲缘关系的其他菌属间具有高度的保守性。通过这些特征可以将在终止子上游的短序列中寻找启动子序列作为重点[11]。在“empty”基因间区，通过Colibri database限定注释基因。在基因间区寻找大肠杆菌广泛使用的转录起始和转录终止信号，且这些信号也被已知的sRNA采用的。然后将重点放在能被大肠杆菌主要RNA聚合酶的σ亚基识别的启动子序列上，在这些序列上选择启动子和终止子间50～400个碱基对的序列，选用与其他菌属细菌基因序列高度保守的序列作为预测的被选序列。通过这种方法在大肠杆菌中产生了24个假设的sRNA的基因，其中两个通过运算被证明是编码sRNA的基因，即rprA和gcvB。

　　2.2 microarray法

　　通过序列探查识别sRNA仍存在困难，因此根据sRNA在有亲缘关系的菌属中高度保守的特性及对转录本的大量分析，采用高密度的寡核苷酸探针微阵来探求位于大肠杆菌基因间区的sRNA的基因。通过这种方法在大肠杆菌体内证明了23个新的RNA分子的存在并通过Northern分析所证实。在这23个基因中有6个推测可能为短的开放读码框，而17个可能是新的功能性的sRNA分子[12]。

　　2.3 RNomic(shotgun cloning)法

　　虽然sRNA包含了大肠杆菌转录本的最重要的部分，但毕竟不是RNA的全部。因为通过试验探查RNA时其实验环境已被限定，而且它稳定的二级结构可能在寡核苷酸微阵探查时已遭到破坏或发生了改变。此外，虽然大多数通过探查得到的sRNA分子是由独立的基因编码的，但是一些sRNA也可通过长的转录本的加工而产生，如大肠杆菌的6sRNA[13]。

　　与依赖于预测的方法不同，RNA的cDNA克隆主要识别那些在给定条件下由一定基因组表达的数目为50～500个核苷酸的RNA分子，而与其是否为独立编码或是否由加工产生无关。这个方法已成功地用于在一些真核生物和古细菌中寻找新的sRNA，此方法包括cDNA文库的构建、生物信息学分析、RNA分离、Northern探查、RNA半衰期的测定及5′和3′末端的快速扩增。

　　3 sRNA的功能和作用机制

　　3.1 与蛋白构成复合体发挥功能 如4.5sRNA与蛋白质构成复合体共同形成信号识别颗粒，参与蛋白质合成后的靶向运输。

　　3.2 模拟其他核苷酸结构发挥功能 如6sRNA。大肠杆菌的RNA聚合酶是一个多亚基酶，其中的δ亚基是识别启动子序列和转录起始所必需的，6SRNA结构与δ亚基识别的启动子相类似，所以6sRNA可以模拟δ亚基识别的启动子与δ亚基结合，从而影响了转录的过程。

　　3.3 通过与靶RNA分子配对发挥功能 这是sRNA发挥功能最为普遍的一种机制。比如从大肠杆菌体内分离出的第一个由染色体编码的sRNA MicFRNA，它可以与ompFmRNA配对而中止OmpF蛋白的翻译[14]。Oxys和DsrA是另外两个通过与靶mRNA配对来发挥调节功能的RNA分子。OxysRNA可以与编码转录激活子的fhlAmRNA配对抑制翻译。相反，DsrA可以与编码RNA聚合酶δ亚基的rpoSmRNA配对，阻止rpos转录本核糖体结合位点闭合二级结构的形成上调翻译[15]。还有一些sRNA分子通过与靶mRNA的配对影响mRNA的稳定性从而在转录水平对基因表达进行调控如Spot42和RyhB[16]，机制总结如图1[17]。

　　图1 小RNA通过与靶mRNA配对发挥

　　其对靶基因表达的调控作用

　　4 调控sRNA与靶基因配对的伴侣分子Hfq

　　Hfq是一类高度保守、数量较多的蛋白，具有RNA分子伴侣活性，参与许多由RNA介导的功能调控[18]。Hfq最初是作为大肠杆菌RNA噬菌体Qβ复制所需要的宿主因子被发现的[19]。进一步的研究表明Hfq与真核细胞和古细菌细胞体内的剪切体和mRNA降解复合体中的核心蛋白Sm和Sm样蛋白同源。与Sm和Sm样蛋白一样，Hfq通过形成六聚体环[20]与sRNA中富含A，U碱基的序列结合通过提高sRNA与靶mRNA的配对调控蛋白的表达。如Oxys，DsrA和RprA RNA在执行其对rpoS的调控时都需要Hfq蛋白的参与。Hfq的缺失将影响许多蛋白的表达并引起相关表型的改变。如生长速度减慢，细胞增大，对紫外光敏感度增加等[21]。此外大肠杆菌Hfq蛋白对于靶mRNA的降解以及编码RNA聚合酶δs亚基的rpoSmRNA的有效翻译都是必需的[22]。

　　5 sRNA的研究动向及展望

　　5.1 sRNA的应用 对于某些细菌，基因敲除是一种耗时的过程，RNAi技术是一种很有用的介导同源基因表达沉默的工具，而sRNA的研究为RNAi的应用提供了依据和思路，相信在不久的将来人们会广泛运用到基因治疗、基因沉默、有目的的基因表达调控上。

　　5.2 研究动向及有待解决的问题 随着研究的深入和越来越多sRNA的发现必将使原核生物基因调控的研究进入新的空间，sRNA作为调控基因表达的重要调节子必将成为研究的热点。然而还有很多问题有待解决。不同微生物体内的sRNA是否具有差异?是否具有不同的分工?sRNA还有什么新的功能?虽然已知sRNA通过碱基配对或模拟二级结构调节mRNA的稳定性或翻译，但许多细节仍然未知。如Hfq可结合sRNA也可与靶mRNA结合但是否Hfq的结合是所有配对所必需的呢?此外，RNA与Hfq结合的位点仍存在争议，是何种机制提升了sRNA与其靶的相互作用也还没有完全阐明。

　　【参考文献】

　　1 Huang HY，Chang HY，Chou CH，et al.sRNAMap:genomic maps for small noncoding RNAs，their regulators and their targets in microbial genomes[J].Nucleic Acids Res,2009,37:150154

　　2 Hindley J.Fractionation of 32 Plabelled ribonucleic acids on polyacrylamide gels and their characterization by fingerprinting[J].J Mol Biol，1967，30(1):125136

　　3 Wassarman KM，Stroz G.6S RNA regulates E.coli RNA polymerase activity[J].Cell，2000，101:613623

　　4 Urbanowski ML，Stauffer LT，Stauffer GV.The gcvB gene encodes a small untranslated RNA involved in expression of the dipeptide and oligopeptide transport systems in Escherichia coli[J].Mol Microbiol，2000，37(4):856868

　　5 Majdalani N，Chen S，Murrow J，et al.Regulation of RpoS by a novel small RNA:the characterization of RprA[J].Mol Microbiol,2001，39(5):138294

　　6 Altuvia S，WeinsteinFischer D，Zhang A，et al.A small，stable RNA induced by oxidative stress:role as a pleiotropic regulator and antimutator[J].Cell，1997,90(1):4353

　　7 Argaman L，Hershberg R，Vogel J，et al.Novel small RNAencoding genes in the intergenic regions of Escherichia coli[J].Curr Biol，2001，11(12):941950

　　8 Altuvia S.Identification of bacterial small noncoding RNAs:experimental approaches[J].Curr Opin Microbiol,2007,10(3):25761

　　9 Vogel J，Sharma CM.How to find small noncoding RNAs in bacteria[J].Biol Chem,2005,386(12):12191238

　　10Livny J，Fogel MA，Davis BM，et al.sRNA Predict:an integrative computational approach to identify sRNAs in bacterial genomes[J].Nucleic Acids Res,2005,33(13):4096105

　　11Ouvier M，Sharma CM，Mika F，et al.Small RNA binding to 5 mRNA coding region inhibits translational initiation[J].Mol Cell，2008，32(6):827837

　　12Hang A，Wassarman KM，Rosenow C，et al.Global analysis of small RNA mRNA targets of Hfq[J].Mol Microbiol，2003,50(4):11111124

　　13Windbichler N，von Pelchrzim F，Mayer O，et al.Isolation of small RNAbinding proteins from E.coli:evidence for frequent interaction of RNAs with RNA polymerase[J].RNA Biol，2008,5(1):3040

　　14Urban JH，Vogel J.Translational control and target recognition by Escherichia coli small RNAs in vivo[J].Nucleic Acids Res，2007，35(3):10181037

　　15Argaman L，Altuvia S.fhlA repression by Oxys RNA:kissing complex formation at two sites results in a stable antisensetarget RNA complex[J].J Mol Biol,2000,300(5):11011112

　　16Massé E，Gottesman S.A small RNA regulates the expression of genes involved in iron metabolism in Escherichia coli[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(7):46204625

　　17Storz G，Opdyke JA，Zhang A.Controlling mRNA stability and translation with small，noncoding RNAs[J].Curr Opin Microbiol,2004,7(2):140144

　　18Zhang Y，Sun S，Wu T，et al.Identifying Hfqbinding small RNA targets in Escherichia coli[J].Biochem Biophys Res Commun,2006,343(3):950955

　　19Zhang A，Wassarman KM，Ortega J，et al.The Smlike Hfq protein increases OxyS RNA interaction with target mRNAs[J].Mol Cell,2002,9(1):1122

　　20Pannone BK，Wolin SL.Smlike proteins wRING the neck of mRNA[J].Curr Biol，2000，10(13):478481

　　21Viegas SC，Pfeiffer V，Sittka A，et al.Characterization of the role of ribonucleases in Salmonella small RNA decay[J].Nucleic Acids Res，2007，35(22):76517664

　　22Moll I，Leitsch D，Steinhauser T，et al.RNA chaperone activity of the Smlike Hfq protein[J].EMBO Rep，2003，4(3):284289