pSNAV2CTGF重组质粒构建及其在人胚肾293细胞中的表达

　　作者：魏见伟 作者单位：青岛大学医学院附属医院脊柱外科，山东 青岛 266003

　　【摘要】 目的 构建含人结缔组织生长因子(CTGF)的腺相关病毒(AAV)表达载体，并观察其在人胚肾293(HEK293)细胞中的表达。方法 以含有人CTGF基因序列的质粒pCMVSPORT6为模板，应用PCR克隆出CTGF基因，采用分子克隆的方法把CTGF克隆到AAV表达载体pSNAV2.0上构建重组质粒pSNAV2CTGF。把重组质粒转染HEK293细胞，用免疫荧光法对重组质粒目的蛋白的表达进行研究，MTT法检测细胞培养上清液中CTGF蛋白的生物学活性。结果 成功构建完全正确的CTGF基因序列的AAV表达载体pSNAV2CTGF，将其转染 HEK293细胞后，免疫荧光检测到目的蛋白的表达，转染后的细胞上清具有促使成纤维细胞增殖的生物学活性。结论 成功构建了真核表达载体pSNAV2CTGF，转染 HEK293细胞后能够表达具有生物学活性的CTGF蛋白。

　　【关键词】 结缔组织生长因子 腺相关病毒 质粒 基因转染 椎间盘

　　CONSTRUCTION OF ADENO ASSOCIATED VIRUS RECOMBINANT PLASMID OF CONNECTIVE TISSUE GROWTH FACTOR AND ITS EXPRESSION IN HEK293 CELLSWEI JIANWEI, WANG DECHUN, HU YOUGU(Department of Orthopaedics, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China) [ABSTRACT]ObjectiveTo construct a recombinant plasmid of adeno associated virus (AAV) expression vector containing human connective tissue growth factor (CTGF) and to study its expression in human embryonic kidney 293 cells(HEK293). MethodsCTGF gene was cloned from pCMVSPORT6 by PCR, then ligated with pSNAV2.0 to form recombinant plasmid pSNAV2CTGF and transducted into HEK293 cells. Immunofluorescence was used to detect the synthesis of CTGF protein in the HEK293 cells, MTT was used to detect the biological activity of CTGF in the supernatant of culture medium after transfection. ResultsA perfect CTGF gene was ligated to pSNAV2.0. after transfected into HEK293 cells, the expression of CTGF protein was observed and detected by immunofluorescence. The conditioned medium after transfection showed the biological activity of stimulating the proliferation of fibroblast. ConclusionThe eukaryotic expression vector, pSNAV2CTGF, is constructed, which can express CTGF protein with biological activity after transfection with HEK293 cells.

　　[KEY WORDS] connective tissue growth factor; adeno associated virus; plasmid; transfection; intervertebral disc

　　结缔组织生长因子(CTGF)是一种富含半胱氨酸的分泌性多肽,是CCN (CTGF、Cef10/ cyr61 和Nov 的缩写) 家族中的成员，参与很多正常的生理过程，如受精卵的植入、胎盘形成、胚胎发育，也参与一些病理过程如伤口愈合、纤维变性等[1]。CTGF还可以刺激许多细胞合成细胞外基质(ECM)蛋白。在纤维化疾病如肝纤维化、肾纤维化、肺纤维化等已经对其进行了大量研究，但其在椎间盘领域中的研究还处在起步阶段。为了研究其在逆转腰椎间盘退变过程中的作用，本研究构建了重组质粒pSNAV2CTGF，并对其在人胚肾293(HEK293)细胞中的表达进行观察。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　携带人CTGF cDNA的pCMVSPORT6质粒购于Openbiosystems公司，腺相关病毒(AAV)表达载体pSNAV2.0购于本元正阳公司，HEK293细胞由青岛大学医学院微生物学教研室罗兵教授惠赠，小鼠成纤维细胞株NIH/3T3细胞由中国人民解放军总医院细胞室赵卉博士惠赠。Taq DNA聚合酶、T4 DNA 连接酶、限制性内切酶KpnⅠ2和EcoRⅠ，质粒小量提取试剂盒及凝胶回收试剂盒均购于Takara公司，质粒大量提取试剂盒WizardPlus Maxipreps DNA Purification System购自于Promega公司，PCR引物合成及产物测序由上海生工工程公司完成，DMEM培养基、胎牛血清购自于Hyclone公司，脂质体Lipofectamine 2000转染试剂购于Invitrogen公司，兔抗人CTGF抗体购于武汉博士德公司，山羊抗兔荧光标记TRITC IgG购于Sigma公司， MTT购于青岛福林生物工程公司。其他试剂均为国产或进口分析纯。

　　1.2 方法

　　1.2.1 引物设计 根据pCMVSPORT6质粒携带人CTGF cDNA的序列，设计引物如下。5′端引物：5′GCCAGGTACC ATGACCGCCGCCAGTATGGGC3′; 3′端引物：5′CTGCGAATTC TCATGCCATGTCTCCGTACAT3′。其中，5′端引物加入KpnⅠ2酶切位点序列，3′端引物加入EcoRⅠ酶切位点序列。

　　1.2.2 CTGF基因扩增及鉴定 PCR反应体系：pCMVSPORT6质粒1.0 μL，引物各0.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 4.0 μL，Taq酶 0.3 μL，ddH2O 16.2 μL。PCR扩增条件为：94 ℃预变性5 min 后进入PCR循环;94 ℃变性1 min，56 ℃复性 1 min，72 ℃延伸 2 min，共30个循环;72 ℃延伸7 min。PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。

　　1.2.3 重组质粒构建 限制性内切酶KpnⅠ2、EcoRⅠ双酶切载体pSNAV2.0，用胶回收试剂盒回收线性化片段。然后通过T4 DNA 连接酶把目的基因CTGF定向克隆到AAV表达载体pSNAV2.0上，反应体系为：缓冲液3.0 μL，载体DNA 1.0 μL，目的基因DNA 2.0 μL ，T4 DNA 连接酶1.0 μL，在16 ℃水浴箱中孵育3 h。

　　1.2.4 重组质粒转化、筛选 将以上产物用TSS法转导入感受态的大肠杆菌DH5α，产物涂布于含氨苄青霉素的LB平板中，37 ℃温箱过夜。第2天挑选平板上中等大小克隆在含有氨苄青霉素的培养基中扩增，按照质粒小量提取试剂盒说明提取重组质粒，得到重组质粒命名为pSNAV2CTGF。对重组质粒进行KpnⅠ2、EcoRⅠ双酶切鉴定。鉴定反应体系：10×BufferH 2 μL，pSNAV2CTGF 1 μL，KpnⅠ2和EcoRⅠ均为0.3 μL， H2O 16.4 μL。挑选鉴定正确的阳性克隆测序。采用Wizard Plus Maxipreps DNA Purification System制备超纯质粒，准备下一步细胞转染。

　　1.2.5 HEK293细胞培养及转染 采用含体积分数0.10胎牛血清的DMEM高糖培养基进行培养。HEK293细胞贴壁不牢固，轻轻吹打即可传代。本实验采用6孔板，把吹打均匀的细胞悬液计数后按照2×105 /L密度接种，第2天达到80%～90%融合时准备进行重组质粒转染。转染步骤为：转染前2 h 更换不含抗生素培养基，每孔为500 μL，按照每孔4.0 μg DNA及10 μL Lipofectamine 2000的比例分别用250 μL培养基稀释，5 min之内混和，室温摇动20 min，使重组质粒和脂质体充分混匀后加入含有细胞的孔中，置于37 ℃体积分数0.05的CO2培养箱中继续培养。相同方法转染pSNAV2.0 空载体作为实验对照。转染24 h后观察293细胞形态的改变。

　　1.2.6 间接免疫荧光检测目的蛋白的表达 转染48 h后，收集各孔内细胞上清液留做MTT。取其中2孔进行间接免疫荧光染色。免疫荧光染色的操作步骤：弃掉培养液，每孔内加入40 g/L的多聚甲醛1 mL，室温固定10 min后，PBS冲洗，用含有山羊血清的封闭液室温封闭10 min，冲洗后细胞上滴加稀释的一抗(1∶100)，4 ℃，湿盒内16 h过夜，对照组内以PBS代替一抗;第2天，PBS冲洗3次，每次5 min，暗室内滴加稀释的荧光标记二抗(1∶40)，室温孵育40 min，彻底冲洗，封片后于荧光显微镜下观察拍照。

　　1.2.7 MTT法检测表达CTGF的生物学活性取对数生长期的NIH/3T3细胞，按照3×103个/孔接种于96孔板，每孔200 μL，每组重复3孔，用含体积分数0.10胎牛血清的DMEM高糖培养基培养10 h后，分别在每孔内加入转染细胞上清液10、30、50、70、90、110 μL, 对照组仅加入空质粒转染后细胞上清,继续培养24 h。每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，培养4 h后弃去孔内培养基，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL，振荡10 min，用酶标仪检测490 nm波长处吸光度值。

　　2 结 果

　　2.1 PCR扩增产物及重组质粒的鉴定

　　琼脂糖凝胶电泳证实PCR扩增产物在1 kb左右出现DNA条带,与CTGF核酸分子理论长度一致，说明已成功扩增出目的基因(图1)。对重组质粒pSNAV2CTGF进行KpnⅠ2、EcoRⅠ双酶切，理论上可以切出1 kb的条带，双酶切结果证实在1 kb 左右出现DNA条带，说明已成功把目的基因克隆到pSNAV2.0载体上(图2)。测序结果为重组质粒中的目的基因的序列完全正确。

　　2.2 pSNAV2CTGF转染HEK293细胞形态观察

　　正常293细胞呈梭形、三角形或不规则形，大小较一致。脂质体介导的重组质粒转染293细胞后，多数细胞胞质肿胀、变形，部分细胞死亡、脱落，出现细胞病变效应(CPE)。

　　2.3 间接免疫荧光检测

　　荧光显微镜下观察，见细胞胞质内出现红色荧光，说明目的基因成功表达。阴性对照组未检测到荧光。

　　2.4 MTT检测

　　实验组细胞上清能够促进NIH/3T3细胞的增殖，且随着重组质粒pSNAV2CTGF上清体积的增加，其促进细胞增殖的作用也增强。

　　3 讨 论

　　CCN家族中包括CYR61/CCN1、CTGF/CCN2、NOV/CCN3、WISP1/CCN4、WISP2/CCN5以及WISP3/CCN6共6种成员，其蛋白功能复杂，参与细胞黏附、生长、分化，胚胎发生及血管性疾病、癌症等[2]。虽然家族中各成员的功能各异，但所有CCN家族成员都具有促进不同的组织或器官血管生成的作用。体外研究证实，CTGF尚具有促进软骨细胞生长和肥大，增加蛋白多糖、聚集蛋白聚糖和胶原表达，以及促进细胞外基质的产生、积聚的功能，广泛参与生成ECM的生理或病理过程[3]。LAU等[4]研究显示，CTGF表达在低水平时具有促进结缔组织增生、伤口愈合和血管形成、骨骼发育等生理性功能。BLOM等[5]则报道，CTGF过量表达会参与慢性炎症性疾病如肾小球硬化、肺纤维化、肝硬化等的形成。目前已有许多研究观察其在肝硬化、糖尿病、肺纤维化等疾病中的生物学作用，但尚未见有报道将其应用于椎间盘退变领域。

　　腰痛是影响人类健康的一种常见病，而椎间盘的退行性改变及其继发的病理过程是引起腰痛的最常见原因[6]。国内外学者已对椎间盘退变的病因和发病机制进行了广泛的研究，分子生物学的发展和新兴生物技术的出现将使得在分子水平上治疗椎间盘退变成为可能。1997年WEHLING等[7]首先提出转基因逆转椎间盘退变的设想。随后许多国内外学者做了大量的工作，并在椎间盘退变的基因治疗领域取得了令人鼓舞的研究成果。在治疗基因选择方面，许多相关研究发现金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP1)、转化生长因子β(TGFβ)、胰岛素样生长因子Ⅰ(IGFⅠ)、骨形态发生蛋白2(BMP2)等均可不同程度地促进蛋白多糖、聚集蛋白聚糖或胶原等的合成;同时还对上述基因的联合转染做了深入的研究。在基因治疗的载体选择方面，越来越多的研究结果表明，AAV是较腺病毒更为理想的载体。AAV具有病毒衣壳稳定，转染效率高，表达稳定，免疫反应小，可转染静止期及分裂期细胞，表达时间长等优点，通常认为是临床试验所用病毒载体中安全性最高的[8]。

　　本研究选择pSNAV2.0为载体，通过基因重组技术把CTGF的cDNA序列克隆到载体上。在目的基因的克隆时，本研究将KpnⅠ2和EcoRⅠ两种限制性核酸内切酶的基因序列设计加入到引物的两端，从而实现了酶切以后CTGF的cDNA序列在载体pSNAV2.0上的定向克隆。这一设计可以最大程度地保证重组质粒的构建达到最佳效率。应用间接免疫荧光技术检测到CTGF蛋白定位于胞质内。MTT法检测到转染上清液中的CTGF具有促进NIH/3T3细胞增殖的生物学活性。本文结果表明，成功地构建了CTGF的AAV表达载体，为基因逆转椎间盘退变的应用研究奠定了理论基础。另外，本文对pSNAV2CTGF进行包装而进一步转染退变椎间盘细胞，观察其对蛋白多糖、聚集蛋白聚糖及胶原等的生物学效应，将为观察CTGF延缓或逆转椎间盘退变提供新的依据。

　　【参考文献】

　　[1]BRIGSTOCK D R. The connective tissue growth factor/cysteinerich 61/nephroblastoma overexpressed (CCN) family[J]. Endocr Rev, 1999,20(2):189206.

　　[2]PERBAL B, BRIGSTOCK D R, LAU L F. Report on the second international workshop on the CCN family of genes[J]. Mol Pathol, 2003,56(2):8085.

　　[3]NAKANISHI T, NISHIDA T, SHIMO T, et al. Effects of CTGF/Hcs24, a product of a hypertrophic chondrocytespecific gene, on the proliferation and differentiation of chondrocytes in culture[J]. Endocrinology, 2000,141(1):264273.

　　[4]LAU L F, LAM S C. The CCN family of angiogenic regulators: the integrin connection[J]. Exp Cell Res, 1999,248(1):4457.

　　[5]BLOM I E, GOLDSCHMEDING R, LEASK A. Gene regulation of connective tissue growth factor: new targets for antifibrotic therapy[J]? Matrix Biol, 2002,21(6):473482.

　　[6]西永明,胡有谷. 椎间盘退行性改变的病因及发病机制[J]. 齐鲁医学杂志, 2003,18(1):100102.

　　[7]WEHLING P, SCHULITZ K P, ROBBINS P D, et al. Transfer of genes to chondrocytic cells of the lumbar spine. Proposal for a treatment strategy of spinal disorders by local gene therapy[J]. Spine, 1997,22(10):10921097.

　　[8]BUNING H, BRAUNFALCO M, HALLEK M. Progress in the use of adenoassociated viral vectors for gene therapy[J]. Cells T Org, 2004,177(3):139150.