乳腺癌VEGFC的表达与淋巴管生成的相关性

　　作者：盛薇，王虎霞，王光辉，樊林，单涛 作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院普外科，陕西西安 710061

　　【摘要】目的 探讨乳腺癌血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor C, VEGFC)的表达与乳腺癌肿瘤淋巴管生成及淋巴结转移的关系。方法 用免疫组化SP法对60例乳腺浸润性导管癌进行VEGFC染色，并用D240标记肿瘤淋巴管。取15例乳腺纤维腺瘤标本做对照。结果 乳腺癌组VEGFC阳性表达率明显高于对照组(P<0.01)。VEGFC表达与乳腺癌淋巴管密度(lymphatic vessel density, LVD)和腋淋巴结转移相关;VEGFC表达阳性组肿瘤淋巴管密度大(P<0.05)，腋淋巴结转移组VEGFC表达水平高。乳腺癌组所有病例均有不同程度的淋巴管染色，以肿瘤间质组织中淋巴管生成为主。淋巴管密度与乳腺癌腋淋巴结转移呈正相关，腋淋巴结转移组的肿瘤淋巴管密度比无淋巴结转移组高(P<0.05)。结论 乳腺癌中存在淋巴管生成，且主要发生在肿瘤间质组织中;VEGFC表达与肿瘤淋巴管生成及腋淋巴结转移相关。

　　【关键词】 乳腺癌;血管内皮生长因子C;D240;淋巴管生成;淋巴结转移

　　VEGFC expression and lymphangiogenesis in breast cancer

　　Sheng Wei, Wang Huxia, Wang Guanghui, Fan Lin, Shan Tao

　　(Department of General Surgery, the First Affiliated Hospital,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)

　　ABSTRACT: Objective To study the expression of VEGFC in breast cancer and its correlation with lymphangiogenes is and lymph node metastasis. Methods Immunohistochemical SP method was adopted in detecting the VEGFC protein expression in 60 cases of breast cancer, and the lymphatic vessels were labeled with D240. We took 15 cases of breast fibroadenoma as controls. Results The rate of VEGFC positive expression in breast cancer was higher than that in the control group (P<0.01). VEGFC expression was positively correlated with lymphatic vessel density (LVD) and axillary lymph node (both P<0.05). VEGFC was significantly higher in lymph nodepositive group than in lymph nodenegative group. Different levels of lymphangiogenesis occurred in all the cases of breast cancer; LVD was significantly higher in VEGFC positive group than that in the negative group, but it was mainly located in tumor stroma, and apparently mature lymphatic vessels were not found in cancer nests. LVD was positively related to the lymph node metastasis in breast cancer. It was obviously higher in lymph nodepositive group than in lymph nodenegative group (P<0.05). Conclusion Lymphangiogenesis occurred in the tumor stroma tissue predominantly. The expression of VEGFC was positively correlated with lymphangiogenesis and axillary lymph node metastasis in primary breast cancer.

　　KEY WORDS: breast cancer; vascular endothelial growth factor C (VEGFC); D240; lymphangiogenesis; lymphatic metastasis

　　淋巴道转移是乳腺癌最常见的转移途径，淋巴结受累程度是决定乳腺癌分期及预后的关键因素之一。肿瘤淋巴管生成是目前国内外研究的热点，检测与淋巴管增生、扩张相关的因素，对乳腺癌转移和预后有一定预测价值。

　　血管内皮细胞生长因子C(VEGFC)是研究较多的特异性促淋巴管内皮生长因子。乳腺癌淋巴管生成及淋巴结转移中，VEGFC发挥着不可忽视的作用。单克隆抗体D240是新近发现的淋巴管内皮标记物，特异性较强[1]。本实验以D240标记肿瘤淋巴管，研究乳腺癌VEGFC的表达与淋巴管生成及淋巴结转移之间的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　收集我院2006年3月-2007年5月乳腺浸润性导管癌石蜡标本60例为研究对象，腋淋巴结转移29例，无转移31例。肿块直径≤2cm 23例，>2cm且≤5cm 30例，>5cm 7例。按WHO乳腺浸润性导管癌病理学分级标准，Ⅰ级19例，Ⅱ级18例，Ⅲ级23例。所有患者均为女性，年龄(45.21±8.23)岁，术前均未接受放、化疗等，均行乳腺癌改良根治术。取门诊乳腺纤维腺瘤石蜡标本15例作为对照。

　　1.2 试剂与方法

　　兔抗人VEGFC多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司;鼠抗人D240单克隆抗体、免疫组化染色试剂盒及DAB试剂盒购自北京中山生物有限公司。采用免疫组化SP法，操作按试剂盒说明进行。行微波抗原修复，一抗工作浓度均为1∶100。PBS缓冲液代替一抗为阴性对照，用已知阳性的结肠癌组织切片作为阳性对照。

　　1.3 结果判定

　　以细胞质显示棕黄色颗粒视为VEGFC阳性着色，无棕黄色颗粒为阴性着色。结合着色范围和染色强度进行半定量处理：在显微镜下(×200倍)随机选取5个视野，以阳性染色细胞占视野中所有细胞的百分比均值作为着色范围。着色范围积分：≤1% 0分，2%-20% 1分，21%-50% 2分，≥51% 3分。着色强度积分：无着色0分，浅着色1分，深着色2分。上述两项积分0-1为阴性(-)，2为弱阳性(+)，3为阳性()，≥4为强阳性()。

　　D240标记淋巴管，可见淋巴管内皮细胞胞质染成棕黄色，直观显示淋巴管壁薄、形态不规则、管腔较大、内皮细胞核相对较稀疏或呈叠状。参照Weidner等[2]的计数方法：先在光镜低倍(×4)视野下寻找微脉管最密集区即“热点”(hot spot)，然后在200倍视野下观察着色的单个细胞和细胞丛，并以此作为1个微脉管。以5个200倍视野(0.74mm2/视野)内微脉管数的平均值为微脉管密度。内皮细胞与基膜均着色者判定为微血管，仅内皮细胞着色者判定为微淋巴管，光镜下难以区分者暂判为微血管。

　　1.4 统计学分析

　　数值均以±s表示，计数资料比较使用χ2检验，计量资料使用t检验和单因素方差分析，使用Spearman进行相关分析。实验数据由SPSS 13.0统计分析软件处理。显著性检验水平α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 VEGFC 在乳腺组织中的表达

　　43例乳腺癌组织可见VEGFC表达阳性，对照组仅2例可见VEGFC弱表达。乳腺癌组VEGFC表达阳性率(71.7%)明显高于对照组(13.3%)，有显著性差异(P<0.01)。乳腺癌腋淋巴结转移组VEGFC表达阳性率(86.2%)明显高于腋淋巴结无转移组(58.1%)，有显著性差异(P<0.05)。VEGFC在不同月经状态、肿块大小、病理分级及雌激素、孕激素受体和人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor2, HER2)的表达分组中，差异无统计学意义(P均>0.05，表1)。表1 VEGFC与乳腺癌临床、病理相关参数的关系(略)

　　乳腺癌组VEGFC表达程度积分值(2.55±1.61)明显高于对照组(0.27±0.70)，差异有统计学意义(P<0.01)。腋淋巴结转移组VEGFC表达程度积分值(3.17±1.28)高于腋淋巴结无转移组(1.97±1.68)，具有显著性差异(P<0.01，图1-图2)。VEGFC表达与乳腺癌淋巴结转移呈正相关(r=0.369，P<0.01)。

　　2.2 淋巴管密度LVD的测定

　　乳腺癌组全部病例均有不同程度淋巴管染色，对照组仅2例有淋巴管散在轻度染色。乳腺癌组淋巴管密度(7.58±2.37)明显高于对照组(0.87±0.64)，具有显著性差异(P<0.01)。乳腺癌淋巴结转移阳性组肿瘤淋巴管密度高于腋淋巴结无转移组(P<0.01，图3-图4)，淋巴管密度与淋巴结转移呈正相关(r=0.636，P<0.01)。淋巴管密度在不同月经状态、肿块大小、病理分级、雌激素、孕激素受体及HER2的表达分组中差异无统计学意义(P均>0.05，表2)。表2 LVD与乳腺癌临床、病理相关参数的关系(略)

　　2.3 乳腺癌LVD 与VEGFC表达的关系

　　VEGFC阳性表达组的肿瘤淋巴管密度大于VEGFC阴性表达组，具有显著性差异(P<0.01，表3)。乳腺癌VEGFC的表达与LVD有明显相关性(r=0.395，P<0.01)，随着VEGFC表达强度的增加，肿瘤淋巴管密度增加。表3 乳腺癌LVD与VEGFC蛋白表达的关系(略)

　　3 讨 论

　　3.1 乳腺癌VEGFC的表达

　　VEGFC是目前研究较多的特异性促淋巴管生长因子。多种肿瘤研究中证实，VEGFC刺激肿瘤淋巴管生成和局部淋巴结转移，其具体作用机制尚不完全清楚。

　　研究表明，肿瘤细胞分泌出VEGFC，经丝氨酸蛋白纤溶酶水解，形成活性形式[3]，与表达于淋巴管内皮细胞上的受体VEGFR3结合，引起Shc 磷酸化和ERK1及ERK2的活化，促进淋巴管内皮细胞增生，从而使淋巴管增生或扩张，加大肿瘤淋巴道转移的机会。VEGFC 的部分蛋白水解加工形式则只能特异性的与VEGFR3 结合，诱导淋巴管生成反应[4]。Skobe等[5]通过乳腺癌动物模型研究肿瘤源性VEGFC 与肿瘤内微脉管生成的关系，结果显示VEGFC 仅选择性诱导肿瘤内淋巴管生成，而不引起血管生成反应。日本学者[6]在胃癌的研究中证实VEGFC/D mRNA的表达促进肿瘤淋巴管生成及淋巴结转移。国内张红星等[7]关于食管癌的研究得出相同的结论，认为VEGFC是预测肿瘤淋巴结转移的重要指标。

　　本研究显示VEGFC主要表达于乳腺癌癌细胞质中，呈现淡黄色或棕黄色颗粒，细胞膜及细胞核未见染色。乳腺癌组VEGFC表达阳性率明显高于对照组，差异显著。可见VEGFC在鉴别乳腺癌和乳腺良性肿瘤中有一定的参考价值。VEGFC表达与肿瘤腋淋巴结转移状态相关，腋淋巴结转移组VEGFC表达阳性率及表达程度均明显高于腋淋巴结无转移组。同时，乳腺癌VEGFC的表达与LVD明显相关，VEGFC阳性组的肿瘤淋巴管密度大。可见，VEGFC促进乳腺癌淋巴管的生成及淋巴结的转移。这与目前国内外研究报道一致。

　　同时，VEGFC表达在不同患者月经状态、肿块大小、病理分级、雌激素、孕激素受体及HER2表达分组中差异无统计学意义。对于VEGFC高表达的病例而未发生淋巴结转移可能是转移处于亚临床状态或者肿瘤的转移还受其他因素的调控;对于VEGFC低表达的病例而发生淋巴转移可能由于除了VEGFC/VEGFR3调控系统外，尚存在其他调控因子介导的淋巴转移机制。有学者认为COX2在肿瘤淋巴管生成中发挥重要作用。关于VEGFC与COX2是否存在相互作用及作用的机制目前尚不清楚[8]。故乳腺癌淋巴道转移的具体机制还有待于进一步研究。

　　3.2 乳腺癌淋巴管的生成

　　乳腺癌中是否有淋巴管生成，新生淋巴管存在于肿瘤实质还是间质，目前尚有争议。Vleugel等[9]认为，乳腺癌发生发展过程中无淋巴管生成，仅在癌边缘及癌旁组织中发现毛细淋巴管。而Stacker等[10]在鼠肿瘤的模型实验中证实了肿瘤内部存在新生淋巴管，认为肿瘤内部淋巴管形成与否主要取决于肿瘤内淋巴管生成因子与实体瘤内部压力二者互相作用的结果。Koyama等[11]研究乳腺癌中VEGFC/D mRNA的表达与淋巴结转移的关系，发现乳腺癌组织中存在淋巴管生成，主要存在于间质组织，不同区域肿瘤间质内淋巴管密度、管腔形状、大小都不一样，癌巢中未发现明显的成形淋巴管。本研究得出与Koyama相同的结论。考虑乳腺癌癌巢内见不到成熟淋巴管，可能由于过度生长的癌细胞导致肿瘤实质内压力增大，压迫淋巴管腔，阻止了功能淋巴管的形成。同时，与乳腺癌属于上皮性肿瘤及淋巴系统发育不完善有关。

　　研究表明，肿瘤淋巴管生成与淋巴结转移密切相关。Nakamura1等[12]认为乳腺癌内部及癌周都存在淋巴管生成，淋巴管密度与淋巴结转移呈正相关。在人小细胞肺癌的研究中发现，肿瘤外周淋巴管密度与淋巴结转移及总生存数相关，认为淋巴管密度是肿瘤淋巴结转移危险性的预测指标[13]。本实验中乳腺癌腋淋巴结转移阳性组肿瘤淋巴管密度显著高于腋淋巴结无转移组(P<0.05)。淋巴管密度在不同月经状态、肿块大小、病理分级、雌激素、孕激素受体及HER2的表达分组中差异无统计学意义，再次证明淋巴管密度可以作为乳腺癌淋巴转移的相对独立预测指标，与国内外文献报道一致。

　　综上可见，乳腺癌中确实存在新生淋巴管的生成，新生淋巴管主要位于肿瘤间质组织中，VEGFC在乳腺癌淋巴管生成及淋巴结转移中发挥重要作用。关于VEGFC发挥作用及肿瘤淋巴管生成的具体机制，尚有待进一步研究。

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