152例大鼠原位全小肠移植的外科技术总结

　　作者：端木浩,梁重峰 作者单位：(东南大学附属第二医院 普外科,江苏 南京 210003)

　　【摘要】 目的:总结大鼠原位全小肠移植的外科手术方法。方法:雄性F344和Lewis大鼠分别为供体和受体。供肠切取范围包括全小肠、门静脉及肠系膜上动脉。供肠肠系膜上动脉与受体肾下腹主动脉端侧吻合采用连续外翻锁边缝合方法，供体的门静脉与受体的左肾静脉端端吻合采用Cuff套管方法，切除受体自体小肠，断端与供体肠吻合重建消化道。供、受体术中均补液4～6 ml。结果：共进行152次移植手术，其中正式实验120次，供体手术时间(60±10) min，受体手术时间(100±15) min，移植肠热缺血时间(30±5) min，78.3%大鼠术后存活超过2周，病理检查证实移植肠病变符合排斥反应特点。结论：供肠获取、血管吻合术、术中血容量维持、保温是大鼠原位全小肠移植术的关键。

　　【关键词】 小肠移植; 大鼠; 移植排斥反应; 微血管吻合

　　Surgical techniques for orthotopic small bowel

　　transplantation in rats: analysis of 152 cases

　　DUAN Muhao, LIANG Chongfeng(Department of Surgery, The Second Hospital Affiliated to Southeast University, Nanjing 210003, China)

　　[Abstract] Objective: To review the surgical technique for orthotopic small bowel transplantation in rats. Methods: The male F344 and Lewis rats were donors and recipients, respectively. The entire small bowel, portol vein and superior mesenteric artery were removed in the donors. Small bowel transplantations were performed by microvacular endtoside anastomosis of the donor superior mesenteric artery, and the recipient infrarenal aorta by continuous lock suture technique and by formation of a ‘cuff’ anastomosis between the donor portal vein and the recipient left renal vein. The small bowel of the recipient was removed and replaced by the graft. Both the donor and the recipient received intravenous administration of 4～6 ml of lactated Ringers solution during the operation. Results: 152 transplantations were performed, among which 120 transplantations were involved in the experiment group. The operation time for the donor and recipient was(60±10) min and(100±15) min, respectively. The warm ischemia time was(30±5)min. 78.3% of the recipients survived over 2 weeks after the operation, and their grafts were harvested for pathological examination. The pathological changes of the grafts were consistent with the features of allograft rejection. Conclusion: Graft harvest, vascular anastomosis, prevention of hypovolemic shock and warm preservation during the operation are the key surgical techniques.

　　[Key words] small bowel transplantation; rats; allograft rejection; microvascular anastomosis

　　小肠移植是肠功能不全需要长期静脉营养支持患者的重要治疗措施，但是相比于其他脏器移植，小肠移植在免疫排斥、感染等方面存在的问题限制了该治疗措施在临床上的运用。对这些问题深入研究需要可靠、重复性好的动物实验模型，其中大鼠小肠移植模型比较常用。然而大鼠小肠移植，尤其是大鼠原位全小肠移植是一项难度较大的实验外科技术。本文将总结我们2年来所建立的152例大鼠原位小肠移植模型中摸索出来的经验和技术。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物

　　健康雄性F344(RT1lv1)和Lewis(RT1l)大鼠分别为供体和受体，体重200～250 g，由北京维通利华公司提供，健康状况符合国家普通实验动物健康标准，大鼠饲养于12 h明暗交替环境，提供充足食物和水，经1周以上时间适应后开始实验。

　　1.2 供体手术

　　术前供体禁食12 h，自由饮水。大鼠在氯胺酮(100 mg·kg-1)腹腔麻醉满意后经尾静脉建立静脉补液通道，缓慢补充乳酸林格液2～3 ml，仰卧固定于手术平板上。取腹正中十字切口入腹，游离屈氏韧带和降结肠韧带，游离结扎肾下腹主动脉阻断下肢动脉血流，游离结扎左肾动脉和腹腔干，游离肠系膜上动脉主干和根部，沿肠系膜上动脉主干寻找结扎切断第一和第二分支，分别为中结肠动脉和胰十二指肠动脉，游离门静脉主干，结扎切断中结肠静脉、脾静脉、胰十二指肠静脉、升结肠动静脉，回结肠动静脉，于屈氏韧带下方和回盲部上方切断小肠，分离出供体全小肠，结扎右肾动脉和肠系膜上动脉上方腹主动脉，于门静脉主干近心端切断，迅速在肾下腹主动脉开口，置入22G静脉留置针，以4 ℃含肝素25 U·ml-1乳酸林格液6～8 ml灌注供体肠至乳白色，切断肠系膜上动脉，注意保留肠系膜上动脉根部周围腹主动脉壁(carrel patch)，以4 ℃含庆大霉素160 U·ml-1乳酸林格液10～20 ml冲洗供体肠腔，将门静脉外翻套至cuff套管上，用80丝线结扎固定，供体肠浸入含肝素25 U·ml-1乳酸林格液内4 ℃保存。

　　1.3 受体手术

　　术前受体禁食8 h，自由饮水。大鼠在氯胺酮(100 mg·kg-1)腹腔麻醉满意后经尾静脉建立静脉补液通道，缓慢补充乳酸林格液2～3 ml，仰卧固定于手术平板上。取腹正中切口入腹，游离屈氏韧带和降结肠韧带，充分暴露后腹膜，游离结扎左肾动脉，游离左肾，于肾门处结扎左肾静脉和左输尿管，切除左肾，游离肾下腹主动脉长度约2 cm，结扎动脉分支，显微血管夹阻断游离动脉远近端血流，动脉开窗大小适合供体肠系膜上动脉开口，含肝素25 U·ml-1林格液冲洗血管腔，取出供体，供体肠系膜上动脉和受体腹主动脉端侧吻合。吻合方法采用Wang等报道的吻合技术[1]：以80血管缝合线在吻合口6点和12点各悬吊1针，半圈连续外翻锁边缝合方法吻合血管，共缝合14～16针。吻合完毕后用1个血管夹阻断供体肠系膜上动脉，开放受体肾下腹主动脉，检查吻合口是否出血，对于少量渗血可使用棉球压迫止血，对于大量渗血必须再次阻断肾下腹主动脉血流后补针。阻断左肾静脉血流，左肾静脉开窗，含肝素25 U·ml-1林格液冲洗血管腔，将cuff套管套入左肾静脉后固定，经尾静脉通道补充林格液2～3 ml，先开放静脉后开放动脉，移植肠由乳白色变为鲜红色。切除从屈氏韧带至末端回肠的受体小肠，断端以60丝线与供体肠断端端端吻合，37 ℃林格液冲洗腹腔，检查无活动性出血后0号线关腹。术中大鼠如果苏醒可皮下注射1/2原剂量氯胺酮，术后受体大鼠置于温箱中，待其麻醉苏醒后送饲养室，术后自由饮水，术后第1天恢复普通饮食。

　　2 结 果

　　本实验分两个阶段共进行152例，第一阶段预试验完成32例，主要目的是熟悉解剖和手术技术训练，摸索术式并将手术步骤标准化和程序化，其中存活最长者超过2周。第二阶段为正式实验，共完成120例手术，其中5例因术中血管吻合口出血死亡，4例因术中吻合口狭窄和血栓形成死亡，这些大鼠系手术操作失误死亡，其余大鼠有17例术后1周内死亡,有94例术后2周左右死亡。术后存活不足1周大鼠死亡后取移植肠送病理，发现肠壁明显充血水肿，肠系膜散在出血点，肠绒毛肿胀破坏，黏膜变薄，黏膜下有中性粒细胞为主的炎症细胞浸润，肠腺显著减少，符合移植肠缺血再灌注损伤表现。术后存活超过2周的大鼠死亡后移植肠送病理，发现移植肠袢粘连成团，肠壁僵硬增厚，肠绒毛结构被破坏，肠腺消失，肠壁全层有淋巴细胞为主的炎症细胞浸润，伴有纤维组织增生，符合移植肠排斥反应表现。正式实验成功率为78.3%。

　　供体手术时间(60±10)min，受体手术时间(100±15)min，其中动脉吻合时间(23±5)min，静脉吻合3 min;移植肠热缺血时间(移植肠脱离低温保存状态至血运恢复的时间)(30±5)min，冷缺血时间控制在60 min以内。整个手术过程1人操作，手术时间约3 h。

　　3 讨 论

　　3.1 供体手术

　　获取高质量的供肠是原位小肠移植成功的关键之一。小肠对机械性损伤和热缺血性损伤较为敏感，因此在供体手术时必须采取相应保护措施。(1) 减少供肠机械性损伤的措施：术中用生理盐水湿纱布覆盖小肠，以避免移植肠干燥。整个手术过程中尽量减少牵拉移动供体肠，用生理盐水湿棉签轻轻拨动供体肠，避免用手和尖锐的器械接触供体。供体大鼠术前禁食12 h后肠腔内容物基本排空，术中用10～20 ml庆大霉素溶液轻柔地灌注便可彻底灌洗肠腔，避免因肠腔过度灌洗导致的机械性损伤。(2) 降低供肠缺血与灌注损伤的措施：开腹手术体液大量丢失，术前皮下补液有利于维持体液平衡。进腹后即结扎腹主动脉远端阻断下肢动脉供血，使下肢血液回流以保证术中肠系膜上动脉的血供。术中处理供体肠血管坚持先结扎动脉再结扎静脉原则，以避免因内脏淤血所致供体肠休克状态。门静脉的胰十二指肠分支较多，需要仔细处理。文献报道过度灌注供肠血管可造成供肠严重的灌注损伤[2]，我们采用6～8 ml灌注液缓慢灌注，以减少供肠的灌注损伤。此外，取供肠时应尽量去除胰腺组织，以防止移植术后胰腺液化，引起腹腔内感染。

　　3.2 受体手术

　　受体手术的技术难点是血管吻合。为了简化动脉吻合操作和缩短手术时间，常用连续半圈缝合方法，但是我们在预试验中发现连续缝合常出现吻合口狭窄或出血。Wang等[1]报道连续锁边缝合使得缝线收紧方向垂直于吻合口，而连续缝合缝线收紧方向与吻合口成锐角或钝角，因此连续锁边缝合可以减少吻合口出血和狭窄。我们使用连续锁边缝合后吻合口出血和狭窄发生机会明显减少。静脉使用cuff套管吻合法明显降低手术难度，但要注意静脉不能扭曲，否则会出现静脉淤血和血栓形成。

　　维持受体血容量是保证受体手术成功的重要因素之一。大鼠的血容量只有其体重的7.4%，肠移植手术时间较长，开腹后体液随时间丢失较多，开放供体肠血流后血液大量分流向供体肠造成失血，再加上移植肠呈高分泌状态而大量丢失肠液，使得受体十分容易发生低血容量性休克。Zhong等[2]在监测大鼠小肠移植术中血液动力学变化时发现血流开放时受体血压显著下降，并指出低血容量性休克是大鼠术后死亡的最主要原因。因此，我们在开腹前和开放供体血流前经尾静脉给受体输入乳酸林格液2～3 ml，以防止低血容量性休克的发生。但如果补液过量(20 ml以上)，则受体极易发生急性左心衰而至动物死亡。

　　保温也是影响受体存活的重要因素之一。长时间的开腹手术使得体温降低，术后大鼠复苏缓慢甚至死亡，这在冬天尤为明显。国外动物实验室多采用专用加热垫保温，我们通过使用空调提高环境温度并在关腹前用37 ℃的生理盐水冲洗腹腔顺利地解决了这个问题。

　　【参考文献】

　　[1] WANG J, MA H, ZHANG H, et al. Continuous locked suture technique for arterial anastomosis in rat small bowel transplantation [J]. Microsurgery, 2007,27(2):112117.

　　[2] ZHONG R, GRANT D, SUTHERLAND F, et al. Refined technique for intestinal transplantation in the rat [J]. Microsurgery, 1991,12(4):268274.