鼠尾悬挂试验在大鼠急性坏死性胰腺炎中的实验意义

　　作者：刘纳新 作者单位：温州医学院第一附属医院 普外科，浙江 温州 325000

　　【摘要】 目的:探讨鼠尾悬挂试验(TST)在大鼠急性坏死性胰腺炎中的实验意义。方法:SD大鼠被分为三组：急性坏死性胰腺炎组(A组，n=8)、急性坏死性胰腺炎鱼油干预组(F组，n=8)和对照组(C组，n=8)。观察各组大鼠胰腺组织病理变化及TST静止时间，同时测定各组5 d后血清SOD、GSH-Px活力和淀粉酶浓度。结果:A组、F组TST静止时间各时间段均显著高于C组(P <0.01);自第2天起F组的数值均小于A组，其中第4、第5天的数值差异有显著性(分别为P <0.05、P <0.01)。病理学检查提示F组的炎性细胞浸润显著低于A组(P <0.01)。A组SOD、GSH-Px显著低于C组(P <0.01)，而F组SOD、GSH-Px显著高于A组(P <0.01)。TST静止时间和病理学改变、SOD、GSH-Px活力具有相关性(P <0.01)。结论:TST静止时间在一定程度上反映了急性坏死性胰腺炎的严重程度;鱼油在改善急性坏死性胰腺炎大鼠的氧化应激指标的同时，对大鼠的TST静止时间产生影响。

　　【关键词】 胰腺炎 急性坏死性 鼠尾悬挂实验 超氧化物歧化 谷胱甘肽过氧化酶

　　Significance of the tail suspension test in rats with acute necrotizing pancreatitis LIU Na-xin*，CHEN Zhou-xun，HUANG Ying-peng，YU Zhen，YAO Jian-gao，CHEN Tong-ke，ZHAGN Xiao-dong，ZHANG Zhong-wei，WANG Peng-fei. *Department of General Surgery，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou，325000

　　Abstract: Objective:To investigate the significance of the tail suspension test in rats with acute necrotizing pancreatitis (ANP). Methods: The male Sprague-Dawley (SD) rats were divided into three groups: ANP group(group A，n=8)，ANP with fish oil treatment group(group F，n =8)and control group(group C，n=8). The immobility time in the tail suspension test and the grade of the severity of pancreatitis were observed. After experiment started for five days，the activity of serum antioxidant enzymes(SOD，GSH-Px) and the concentration of serum amylase in rats of each group were measured respectively. Results: The immobility time in the tail suspension test of group A and F were significantly longer than that of group C (P <0.01). Since the second day after the experiment has started，the immobility time in the tail suspension test of group F was shorter than that of group A. However，only on the 4th and 5th day，this difference showed statistic significance (P <0.05 and P <0.01 respectively). Histopathological analysis suggested the infiltration of that inflammatory cells in group F was significantly weaker than that of group A (P <0.01). Serum glutathione peroxidase (GSH-Px) and superoxide dismutase (SOD) level in group A were significantly lower than that in group C (P <0.01)，and these parameters of group F were significantly higher than those of group A (P <0.01). The duration of immobility in the tail suspension test was related to the histopathological changes and the activity of serum SOD and GSH-Px. Conclusion: The duration of immobility in the tail suspension test is correlated with the severity of ANP，and fish oil can affect the ANP rats’behaviour，and improves the severity of acute necrotizing pancreatitis.

　　Key words: pancreatitis，acute necrotizing;tail suspension test;superoxide dismutase;glutathione peroxidase

　　脑-肠轴通过神经内分泌网络对消化道疾病的影响近年来颇受关注。临床上急性胰腺炎患者病情加重后常出现反应迟钝、表情淡漠等精神异常。由于精神症状难以定量以及脑-肠轴自身的复杂性，脑-肠轴在急性胰腺炎病理过程中的作用鲜见报道。本研究应用鼠尾悬挂试验(tail suspension test，TST)对急性坏死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis，ANP)大鼠伴随的精神症状作量化分析，同时结合氧化应激理论进一步探讨TST在大鼠ANP中的实验意义。

　　1 材料和方法

　　1.1 药物及试剂 牛磺胆酸购自Sigma公司。α-淀粉酶液体试剂盒购自上海申能公司。SOD、GSH-Px试剂盒购自南京建成试剂公司。鱼油(注射液进口分装批号J20050079，奥地利费森尤斯卡比公司制)、 20%脂肪乳剂购自无锡制药有限公司。

　　1.2 动物分组和造模

　　1.2.1 动物分组：29只健康雄性SD大鼠，由温州医学院实验动物中心提供，体重220～240 g。随机取其中8只作为对照组(control group，C组);另21只制成急性坏死性胰腺炎模型，取24 h后尚存活的16只大鼠再次随机分为急性坏死性胰腺炎模型组(ANP group，A组，n=8)和鱼油干预组(Fish oil group，F组，n=8)。

　　1.2.2 造模方法和动物处置：参照黄克俭等[1]的方法制作急性坏死性胰腺炎模型。予2%戊巴比妥钠按60 mg·kg-1剂量腹部皮下注射麻醉，背位固定，备皮消毒后，沿腹白线开腹。A组：在十二指肠肠壁戳孔，通过十二指肠乳头将4号平头针置入胆胰管开口内1 cm，随即匀速向胆胰管内注射3.5%牛磺胆酸钠(剂量：2 mg·kg-1，速度：0.5 ml·min-1);注药期间分别阻断胆胰管上下端，以防牛磺胆酸钠注入肝脏和逆流入十二指肠;注药后继续阻断胆胰管上下端5 min;见胰腺表面淡红色液体渗出，荷包缝合肠壁穿刺孔，逐层关腹。F组：造模方法与A组完全相同，仅在术后予以鱼油干预。C组：在十二指肠肠壁戳孔，4号平头针置入胆胰管开口后随即拔除，肠壁穿刺孔荷包缝合，逐层关腹。

　　三组动物术后24 h内均禁食但不禁水。第24 h开始，F组每天皮下注射10%鱼油脂肪乳(2 ml·kg-1·d-1)，C组和A组皮下注射对等热量的20%普通脂肪乳(1 ml·kg-1·d-1，加用相同容积的生理盐水稀释1倍后注射)，同时各组改为自由饮水、饮食。术后24 h予以进食后检测各组大鼠的鼠尾悬挂试验，连续5 d。术后第5天麻醉后处死各实验组大鼠，处死前腹腔静脉取血并离心取血清，血清保存于-80 ℃冰箱待作相关血清学测定;取胰头组织一块固定于1O%甲醛待病理学检查。(注：本实验采用皮下注射用药，用药后未发现大鼠搔扒用药部位和局部硬结形成;该方法操作简便，避免了静脉内置管应用肝素抗凝对实验的影响。)

　　1.3 检测指标及方法

　　1.3.1 鼠尾悬挂试验:参照文献[2]从第30小时和第5天开始进行TST：在鼠尾近心端5 cm的部位用线栓住，使动物离地30 cm 呈倒挂状，悬挂两侧用板隔开动物视线。动物为克服不正常的体位而挣扎活动，但活动一定时间后，出现间断性“不动”显示“失望”状态。用秒表记录悬尾后6 min内累计不动时间。

　　1.3.2 病理学检查：10%甲醛固定的胰腺标本行常规石蜡包埋切片，HE染色，高倍镜下观察病理变化并按照吴建新的方法[3]进行改良Schmidt评分。

　　1.3.3 淀粉酶和SOD、GSH-Px活力检测：取保存于-80 ℃冰箱的血清，利用相应试剂盒，用日立全自动生化分析仪检测实验动物的血清淀粉酶浓度，用分光光度法测定血清SOD和GSH-PX活力。

　　1.4 统计学处理方法 数据分析采用SPSS13.0软件包，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。

　　2 结果

　　2.1 一般状况及鼠尾悬挂试验结果 入选大鼠在观察期间全部存活。C组行动敏捷，进食和饮水与术前基本相仿;A组大鼠行动缓慢，对外界刺激反应迟钝，腹胀随时间延长而加重;F组对外界刺激反应灵敏，初期有腹胀，后期缓解。

　　鼠尾悬挂试验：随着观察时间推后，C组和F组大鼠悬尾静止时间逐日缩短，而A组时间缩短不明显。A组和F组的TST静止时间显著高于同期C组(P<0.01);从第2天至第5天，F组的TST静止时间短于同期A组数值，其中第4、第5天的数值差异有显著性(P<0.05和P<0.01)(见表1)。

　　2.2 光镜下胰腺组织学检查结果 C组：腺叶、腺泡完整，腺泡间隙致密，未见出血及坏死，偶有少量炎性细胞浸润(见图1a)。A组：无正常腺叶轮廓，中央区可见大片无结构坏死区;周缘可见大片腺泡组织结构丧失，残存的腺泡组织腔内无分泌物;坏死腺细胞呈点状、片状分布，其间可见大量白细胞浸润;组织间隙见红细胞分布(见图1b)。F组：中央区可见大片无结构坏死区，周缘可见部分腺叶轮廓，残存的腺泡组织腔内有分泌物，炎性细胞浸润明显少于相同时间点的A组(见图1c)。

　　对A、F组的胰腺的水肿、坏死、炎性细胞浸润和出血进行Schmidt评分，结果提示，F组炎性细胞浸润与A组比较显著下降(P<0.01，见表2)。

　　2.4 血清淀粉酶、SOD以及GSH-Px活力测定结果 三组血清淀粉酶测定结果差异无显著性;A组血清SOD、GSH-Px活力显著低于C组(P <0.01);F组血清SOD、GSH-Px活力显著高于A组(P <0.01)，与C组比较差异无显著性(见表3)。

　　2.5 相关分析 分别将A组和F组TST静止时间与Schmidt评分、SOD、GSH-Px活力进行相关分析，结果显示，TST静止时间与GSH-Px活力呈显著负相关(r =-0.787，P =0.00);与SOD活力呈显著负相关(r =-0.835，P =0.00);与炎性细胞浸润呈显著正相关(r =0.665，P =0.005)。

　　3 讨论

　　在临床上可观察到ANP患者随着疾病加重出现精神神经异常，而动物实验亦可观察到ANP组大鼠对外界刺激反应迟钝的现象，但由于检测手段等诸多限制，对这方面的研究相对缺乏。TST是反映动物情绪异常以及筛选抗抑郁药物的经典试验之一。Pelloux等[2]在关于酒精和抑郁症关系的研究中，将该试验作为小鼠是否存在抑郁症的筛选方法，另有研究将其作为术后疲劳综合征的重要评价指标[5]。本实验发现，A组大鼠的TST静止时间明显长于C组(P<0.01)。从第2天至第5天F组的TST静止时间均短于A组，其中第4、第5天差异有显著性(P<0.05，P<0.01)。说明ANP大鼠发病后，由于脑-肠轴的作用，胰腺炎症导致与中枢相关的精神状况出现异常;而鱼油的应用可使ANP大鼠的精神症状得以改善。

　　胰酶破坏和氧化应激是急性胰腺炎发病机制中的两大重要理论体系。本研究发现，与正常胰腺比较，A组和F组的胰腺均出现大片无结构坏死区，组织间隙有大量白细胞和红细胞分布;但F组炎症反应相对不严重，而且坏死区内可见残存部分尚具有分泌功能的腺泡组织;对病理标本进行Schmidt评分，F组的炎性细胞浸润评分显著低于A组(P <0.01)。A组的SOD、GSH-Px活力显著低于C组(P <0.01)，而F组SOD和GSH-Px活力较A组显著升高(P <0.01)。以上结果表明，大鼠ANP诱发后，可出现胰腺组织坏死、出血和炎性细胞浸润，同时出现全身性的氧化应激反应;而鱼油干预可减少ANP大鼠胰腺炎性细胞浸润，且通过影响氧化应激改善ANP。本实验尚对TST静止时间和胰腺Schmidt评分、SOD和GSH-Px活力进行了相关性分析，发现TST静止时间和Schmidt炎性细胞浸润评分呈正相关，和SOD及GSH-Px活力存在负相关。说明大鼠精神状况改变和ANP的严重程度具有一定关系，鱼油在改善ANP的同时还对大鼠的精神状况发生影响;而TST可作为检测ANP大鼠的精神和体力较好的方法。

　　本实验各组的血清淀粉酶无明显差异，可能与我们在ANP诱发后5 d取血有关，此时血清淀粉酶可能已经自行下降了。另外，本实验结果不能判断F组的一般状况的改善是炎症缓解后的间接结果，还是鱼油直接作用于高级中枢发挥的作用，进一步明确尚需对ANP胰腺炎症变化与高级中枢可能存在的某种通路进行深入探讨。

　　【参考文献】

　　[1] 黄克俭,花天放,孔今城,等. 静脉输注脂肪乳剂对急性坏死性胰腺炎大鼠脂质炎性介质的影响[J].上海医学, 1998, 21(12):700-702.

　　[2] Pelloux Y, Hagues G, Costentin J, et al. Helplessness in the tail suspension test is associated with an increase in ethanol intake and its rewarding effect in female mice[J]. Alcohol Clin Exp Res,2005,29(3):378-388.

　　[3] 吴建新,袁耀宗,徐家裕,等.大鼠急性坏死型胰腺炎病理特征评定方法的研究[J]. 中国实验动物学报, 2002,l0(4):210-213.

　　[4] Cryan JF, Mombereau C, Vassout A. The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: review of phar-macological and genetic studies in mice[J].Neurosci Biobehav Rev,2005,29(4-5):571-625.

　　[5] 杨建新,杨明. 腹部术后疲劳综合征大鼠模型的建立及其评价[J]. 中国普通外科杂志,2005,14(1):40-43.