MTA1 mRNA与ki67蛋白在乳腺癌组织中的表达及临床意义

　　作者：何春兰　陈平　苗毅    作者单位：225001　江苏省苏北人民医院普外科，210029　南京医科大学第一附属医院普外科 　　【摘要】  目的：观察MTA1 mRNA与ki67蛋白在乳腺癌组织中的表达，探讨二者与乳腺癌的相关性。方法：应用原位核酸分子杂交检测乳腺癌组织中MTA1 mRNA的水平，应用免疫组织化学技术检测乳腺癌组织中ki67蛋白的表达，分析二者与乳腺癌的相关性。结果：MTA1 mRNA、ki67蛋白在乳腺癌低分化组的表达明显高于高、中分化组（P<0.01），淋巴结转移组明显高于无淋巴结转移组（P<0.01）。MTA1 mRNA、ki67蛋白在c-erbB2阳性组的表达水平高于c-erbB2阴性组（P<0.01），MTA1 mRNA、ki67蛋白在ER阳性组的表达水平低于ER阴性组（P<0.05）。ki67蛋白与MTA1 mRNA的表达呈正相关，r=0.553。结论：MTA1 mRNA和ki67蛋白的表达与乳腺癌的发生、发展密切相关，可以作为判断乳腺癌预后的重要分子标志物。

　　【关键词】  乳腺肿瘤·MTA1 mRNA·ki67蛋白

　　Expressions and clinical significance of MTA1 mRNA and ki67 in breast cancer tissue

　　HE Chun-lan, CHEN Ping1, MIAO Yi

　　Department of General Surgery, Subei Hospital of Jiangsu Province （Yangzhou 225001, China），Department of General Surgery, the First Hospital of Nanjing Medical University （Nanjing 210029, China）

　　【ABSTRACT】 Objective: To observe the expressions of MTA1 mRNA and ki67 in breast cancer tissue and to investigate the relation between the two indexs and their correlation with the invasion ability of breast cancer. Methods: The expressions of MTA1 mRNA and ki67 were detected by ISH and IHC,respectively. And their correlation was analysed. Results: The expressions of MTA1 mRNA and ki67 in the poorly differentiated group of breast cancer were significantly higher than that in the moderately and well differentiated groups（P<0.01）. The expressions of MTA1 mRNA and ki67 in groups having lymph nodes metasis were significantly higher than those in no-lymph nodes metasis groups（P<0.01）. The expressions of MTA1 mRNA and  ki67 were higher in cerbB2 positive group than nigative group（P<0.01）. And ti was also higher in ER negative group（P<0.05）. The expressions of MTA1 mRNA and ki67 were positive correlated with each other（r=0.553）. Conclusion: The high expressions of MTA1 mRNA and ki67 are closely related with the development and progress of breast cancer, accompanying with the progress of the disease and the decreasing of tumor differentiation extents. MTA1 mRNA and ki67 can be the important molecular markers which indicate the prognosis and treatment of breast cancer.

　　【KEY WORDS】 Breast neoplasms·MTA1 mRNA·ki67 　　　　远处转移是乳腺癌患者死亡的主要原因［1］。如何减少肿瘤细胞的远处转移是提高手术成功率和患者存活率的关键。转移相关基因蛋白（metastasis-associated genes protein，MTA）是一个不断快速增长的基因家族，由一组（70~80）×103多肽组成，现已确认3类（MTA1、MTA2和MTA3）。ki67蛋白是一种与增殖细胞相关的核抗原，可以较好地反映细胞的增殖活性，ki67蛋白的表达与恶性肿瘤的发展、转移及预后有关［2］。本研究应用原位核酸分子杂交方法检测乳腺癌组织中MTA1 mRNA的表达，应用免疫组织化学染色检测ki67蛋白的表达，分析MTA1 mRNA、ki67蛋白与乳腺癌临床病理因素之间的关系，以及MTA1 mRNA与ki67蛋白间的关联，探讨MTA1 mRNA和ki67蛋白在乳腺癌发生、发展过程中的作用。

　　1　资料与方法

　　1.1　一般资料　

　　选取扬州大学第一附属医院普外科2006年1月—2008年1月手术切除的乳腺癌组织标本90例，均为女性，年龄28~69岁，平均年龄45.2岁。TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期63例，Ⅲ～Ⅳ期27例；组织学类型：浸润性导管癌80例，浸润性小叶癌8例，髓样癌2例；腋窝淋巴结有转移31例，无转移59例。组织学分级：高、中分化58例，低分化32例。ER阳性组32例，ER阴性组58例。c-erbB2阳性组35例，c-erbB2 阴性组55例。全部病例均经病理组织学确诊，且术前均未接受化疗、放疗或内分泌治疗等辅助治疗。

　　1.2　方法　

　　标本经石蜡包埋后作4 μm厚连续切片，行HE染色、原位核酸分子杂交和免疫组织化学检测。

　　1.2.1　MTA1 mRNA原位杂交　

　　根据GenBank中人MTA1全长cDNA序列（NM-004689）及shRNA的设计原则［3］，用BI391 DNA合成仪（美国PE公司生产）合成MTA1mRNA寡核苷酸探针，采用德国Boehringer Mannheim公司3’-digoxigenin-VN试剂盒标记。组织切片浸入二甲苯10 min移除石蜡，以100%乙醇浸泡10 min×2次，空气干燥10 min，在浓度为95%、80%、70%的乙醇中分别浸泡1 min。PBS冲洗 5 min×3次，在2×SSc孵育10 min，每张切片滴加40 μL预杂交液，室温孵育2 h；甩干杂交溶液，滴加30 μL探针杂交液（内含20 ng地高辛标记的MTA1 mRNA），4 ℃湿盒内孵育3 h。振荡漂洗切片后滴加显色液，封片剂封片。　　　　阳性染色为细胞质内见棕黄色颗粒，信号越强，颜色越深。阴性对照片内为无色。

　　1.2.2　免疫组织化学染色　

　　对乳腺癌组织标本进行ki67蛋白免疫组织化学染色。标本常规方法脱蜡，按试剂盒说明书进行操作。用已知阳性乳腺导管癌切片作阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。

　　1.3　结果判断

　　1.3.1　乳腺癌组织MTA1 mRNA染色结果判定　

　　MTA1蛋白主要在细胞核表达，部分细胞质也呈阳性反应，颗粒呈棕黄色。参照Salvesen等［4］的方法，在高倍镜下计数肿瘤细胞总数和阳性细胞的个数，得出阳性细胞百分率。染色强度评分标准：不着色为0分，黄色为1分，棕黄色为2分，黄褐色为3分。阳性细胞比例评定标准：阳性细胞比例<10%为0分，10%～40%为1分，41%～70%为2分，＞70%为3分。2种评分结果相加:0~1分为-，2分为+，3~4分为++，5~6分为+++。进行统计学处理时将≥2分的归入阳性。对测量视野的选择采用相对定量法，遵从随机原则。所有染色结果的判定均采用统一评分标准和双盲法，在完全不知样本临床资料的情况下，由2名研究者分别对实验结果进行评判、打分。所有评分过程重复3次以上。

　　1.3.2　乳腺癌组织ki67蛋白染色结果判定　

　　ki67蛋白阳性染色定位于细胞质和细胞核，以细胞核为主，颗粒呈棕黄色。采用相对定量法：在400倍高倍镜下对每张切片随机选择5个视野，每个视野计数200个细胞，计算阳性细胞占镜下细胞的百分比。阳性细胞比例<10％为-；10％～25％为+；26％～50％为++；>50％为+++。阳性细胞数≥10％为计阳性病例。

　　1.4　统计学处理　

　　应用SPSS10.0统计软件包进行分析，组间率的比较采用χ2检验。相关分析采用Spearman检验。检验水准α=0.05。

　　2　结果

　　2.1　MTA1 mRNA在乳腺癌组织中的表达　

　　低分化组MTA1 mRNA的表达明显高于高、中分化组（χ2=7.26，P＜0.01）；Ⅰ～Ⅱ期与Ⅲ～Ⅳ期病例比较，MTA1 mRNA表达未见明显差异（χ2=3.76，P>0.05）；淋巴结转移组MTA1 mRNA的表达明显高于无淋巴结转移组（χ2=5.31，P＜0.05）；ER阴性组MTA1 mRNA的表达明显高于ER阳性组（χ2=5.26，P＜0.05）；c-erbB2阳性组MTA1 mRNA的表达明显高于c-erbB2 阴性组（χ2=7.78，P＜0.01，表1，图1）。

　　2.2　ki67蛋白在乳腺癌组织中的表达　

　　低分化组ki67蛋白的表达明显高于高、中分化组（χ2=7.78，P＜0.01)，Ⅰ～Ⅱ期低于Ⅲ～Ⅳ期（χ2=4.98，P＜0.025）；有淋巴结转移组明显高于无淋巴结转移组（χ2=7.15，P＜0.01）；ER阴性组明显高于ER阳性组（χ2=5.45，P＜0.025）；c-erbB2阳性组高于c-erbB2阴性组（χ2=4.98，P＜0.05，见表1，图2）

　　2.3　MTA1 mRNA与ki67蛋白在乳腺癌组织中表达的相关性　

　　ki67蛋白在MTA1 mRNA阳性组中的表达率为80.0％（52/65），高于阴性组中的32.0％（8/25）。Spearman等级相关分析示ki67蛋白与MTA1 mRNA表达呈正相关（r=0.553，P<0.01，表2）。

　　3　讨论　　　　MTA是一个不断快速增长的基因家族，MTA1是MTA家族的奠基者，Pencil等［5］利用相差杂交技术从具有转移潜能的鼠乳腺癌细胞13762NF中分离出MTA1基因，在有转移潜能的鼠乳腺癌细胞株中其mRNA的表达是非转移潜能的鼠乳腺癌细胞株的4倍，与肿瘤转移能力呈正相关，被命名为MTA1。应用荧光原位杂交技术发现人MTA1基因位于染色体14q32.3［6］，动物实验证实，MTA蛋白在乳腺癌发展的多阶段都有广泛的表达，而且每种MTA蛋白在细胞的特殊阶段有独特的表达模式［7］。　　　　MTA1在许多肿瘤中都呈过表达，且与肿瘤的浸润转移密切相关［8］。本研究显示，应用原位核酸杂交技术能够在乳腺癌细胞质内检测到MTA1的表达，低分化组MTA1 mRNA的表达明显高于高、中分化组 （χ2=7.26，P＜0.01）；淋巴结转移组明显高于无淋巴结转移组（χ2=5.31，P＜0.05）。MTA1 mRNA的表达与乳腺癌分化程度、临床分期、淋巴结转移等临床病理因素相关，与文献报道相近［9］。　　　　MTA1在乳腺癌发展过程中的确切机制尚不明确。在大多数文献中，强调其通过调节细胞转录水平使某些基因表达产物异常而参与肿瘤的侵袭和转移。MTA1促进乳腺癌转移的分子机制可能与组蛋白去乙酰化转录调节有关。肿瘤细胞转移时，细胞间黏附力的下降与细胞表面黏附分子、细胞骨架蛋白的表达，新生血管的形成以及转移部位的选择均受到复杂网状转录系统调控［10-11］。MTA1可能正是通过对这些细胞转录水平的调控来调节与肿瘤转移相关蛋白的水平，从而参与肿瘤细胞侵袭转移的过程。MTA1可能成为判断乳腺癌浸润、转移及预后等的参考指标并成为乳腺癌治疗的新靶点。　　　　ki67蛋白是一种与细胞增殖密切相关的标志性核抗原，G1期开始表达，G2～M期表达最强，M期后递减，G0期不表达［12］。ki67蛋白的表达与乳腺癌组织分化程度、临床分期及淋巴结转移等临床病理因素密切相关。并能可靠而迅速的反映恶性肿瘤的增殖率，与恶性肿瘤的发展及预后有关。ki67表达的高低对评价肿瘤细胞的增殖状态、研究肿瘤的生物学行为、判断其危害性具有重要意义，并且ki67蛋白的表达与肿瘤的分化程度及浸润转移有关［13］。　　　　目前关于乳腺癌MTA1和ki67蛋白之间相关性研究还很少。本研究发现，在乳腺癌组织中，MTA1 mRNA与ki67蛋白的表达呈正相关，提示在乳腺癌的发生、发展中，二者相互作用，促进乳腺癌细胞的增殖、浸润和转移，可作为肿瘤发生及恶性肿瘤浸润转移的预测指标。联合检测有可能用于筛选有高转移潜在危险的患者。

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