塞来昔布联合顺铂对SGC-7901人胃癌细胞凋亡及Bcl-2表达的影响

塞来昔布联合顺铂对SGC-7901人胃癌细胞凋亡及Bcl-2表达的影响作者：崔京远　马红　李梅　杨洁　张峻　周东风    作者单位：青岛大学附属青岛市立医院　普外科　(山东　青岛　266011)    【摘要】  目的: 探讨选择性环氧化酶-2 (COX-2)抑制剂塞来昔布联合顺铂对SGC-7901人胃癌细胞生长、凋亡及Bcl-2表达的影响。方法: 终浓度为100、200及300 μmol/L的塞来昔布作用于SGC-7901人胃癌细胞24 h后加入顺铂(2.0 μg/mL)，采用MTT比色法测定细胞的生长抑制率，流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡率及Bcl-2表达水平。结果：不同浓度的塞来昔布对SGC-7901人胃癌细胞均有抑制作用，抑制率与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05);流式细胞学检测到凋亡峰，细胞阻滞于G0/G1期。同时伴随Bcl-2表达水平下降，其抑制作用呈时间-剂量依赖性，且以上抑制作用与顺铂具有协同作用。结论：塞来昔布能促进顺铂诱导胃癌细胞凋亡，进而抑制胃癌细胞的增殖，这可能是COX-2抑制剂抗肿瘤的机制之一。    【关键词】  塞来昔布·顺铂·胃肿瘤·Bcl-2·细胞凋亡    Effects of apoptosis and Bcl-2 expression by celecoxib with Cisplatin in SGC-7901 human gastric cancer cell line　CUI Jing-yuan, MA Hong, LI Mei, YANG Jie, ZHANG Jun, ZHOU Dong-feng　Department of General Surgery, Qingdao Municipal Hospital (Qingdao 266011, China)　　【ABSTRACT】 Objective： To study the effects of celecoxib,a selective COX-2 inhibitor, with cisplatin on cell proliferation, Bcl-2 Expression and apoptosis in SGC-7901 human gastric cancer cell line and to explore its anti-neoplasm mechanism. Methods： MTT assay was used to determine cell proliferation after incubation in different concentrations(100，200，300μmol/L) of celecoxib with cisplatin(2.0 μg/mL). Flow cytometry was adopted to examine apoptotic rate, cell cycle and Bcl-2 level. Results： Celecoxib significantly inhibited the growth of SGC-7901 human gastric cancer cells and elevated the inhibiting rate compared with control group(P<0.05). The apoptotic peak was detected with FCM and cells were blocked in G0/G1 stage . The inhibiting effects were in dose and time dependent manner， and were associated with decrease of Bcl-2 level. Conclusion： COX-2 inhibitor celecoxib can accelerate the apoptosis induced by cisplatin and inhibite the proliferation in SGC-7901 human gastric cancer cell line. The results indicate one of the mechanisms of the anti-cancer effect of COX-2 inhibitor.　　【KEY WORDS】 Celecoxib·Cisplatin·Stomach neoplasms·Bcl-2·Apoptosis　　近年研究发现，环氧化酶-2(cyclooxygenase,COX-2)在人类多种恶性肿瘤中高表达，在胃癌组织及胃癌细胞系中COX-2表达量为基础表达量的20～80倍[1-2]。高选择性 COX-2抑制剂有望成为防治胃肠道肿瘤的一类新药，可通过抑制COX而抑制肿瘤的生长，同时还通过非COX依赖途径发挥抗肿瘤作用，但其抗肿瘤的确切机制尚不清楚[3-5]。本研究应用选择性COX-2抑制剂塞来昔布(celecoxib)联合顺铂(cisplatin，DDP)作用于SGC-7901人胃癌细胞，观察胃癌细胞生长及凋亡的变化，旨在探讨其抗肿瘤的作用机制及防 治胃癌的可行性。1　材料与方法　　1.1　主要材料与试剂　SGC-7901人胃癌细胞由我院中心实验室传代培养。RPMI-1640培养基为Gibco公司产品;鼠抗人Bcl-2-FITC为法国国际免疫公司产品;DDP为济南齐鲁制药厂产品;塞来昔布购自辉瑞公司。　　1.2　方法　　1.2.1　细胞培养　以1.0×105 mL-1密度接种SGC-7901细胞在含10%新鲜小牛血清、100 U/mL青霉素及100 μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，置37 ℃、 5% CO2、饱和湿度下培养，实验时取对数生长期细胞。　　1.2.2　细胞的药物处理　实验分4组，取对数生长期的SGC-7901人胃癌细胞，吸去培养液，对照组为仅加入RPMI-1640培养液者;塞来昔布组分别加入终浓度为100、200及300 μmol/L的塞来昔布;塞来昔布+DDP组为加入100、200及300 μmol/L的塞来昔布作用4 h后加入2.0 μg/mL DDP;DDP组为仅加入2.0 μg/mL DDP者，隔天换液1次。并于倒置显微镜下观察，分别于24、48、72 h收集细胞用于实验。　　1.2.3　细胞生长抑制率检测　采用MTT比色法测定各组对SGC-7901人胃癌细胞的生长抑制率。　　1.2.4　流式细胞学检测　分别收集各组细胞106个，以70%乙醇固定24 h后，冷PBS液洗涤2次，离心后弃上清，碘化丙啶0.5 mL 重悬细胞，室温下避光染色30 min，上流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡率及Bcl-2蛋白表达水平。　　1.2.5　细胞形态学观察　取各组细胞，培养24 h后倒去培养液，用4%的多聚甲醛固定，PBS缓冲液冲洗，HE染色，光学显微镜下观察。　　1.3　统计学处理　采用SPSS 11.5统计软件包进行分析，数据用x±s表示。P≤0.05 为差异有统计学意义。2　结果　　2.1　各组对SGC-7901人胃癌细胞增殖的影响　终浓度为100、200、300 μmol/L的塞来昔布作用于SGC-7901人胃癌细胞后，随时间延长，细胞的生长均受到抑制，抑制率与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);同时发现塞来昔布+DDP组对胃癌细胞生长抑制作用更明显，抑制率与塞来昔布组、DDP组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，且随培养基中塞来昔布浓度增加和时间的延长，抑制作逐渐增强(表1)。　　2.2　各组对SGC-7901人胃癌细胞凋亡的影响　流式细胞仪分析表明，胃癌细胞在塞来昔布作用后表现为G0/G1期阻滞，在G1峰前出现凋亡峰(AP峰)。塞来昔布对胃癌细胞的凋亡诱导作用呈时间依赖性及剂量依赖性，如100 μmol/L 塞来昔布作用SGC-7901人胃癌细胞24、48及72 h的细胞凋亡率分别为5.8%、15.6%及22.2%;而300 μmol/L塞来昔布分别作用SGC-7901人胃癌细胞24、48及72 h的细胞凋亡率分别为6.9%、20.3%及29.7%，这种变化趋势与细胞形态学观察所见的凋亡特征的细胞变化趋势相一致。光学显微镜下可见到细胞核固缩、染色质凝聚、核碎裂、凋亡小体形成等典型的细胞凋亡的形态学变化(图1)。不同浓度的塞来昔布+DDP组作用SGC-7901人胃癌细胞后，细胞凋亡率较塞来昔布组、DDP组明显增加(表2)。　　2.3　各组对SGC-7901人胃癌细胞Bcl-2蛋白表达的影响　对照组Bcl-2蛋白的阳性表达率为38.9%，塞来昔布组，DDP组及塞来昔布+DDP组药物作用后24 h， Bcl-2蛋白表达的阳性率分别为27.5%，28.6%及21.9%，且随作用时间延长，其表达水平越低。3　讨论　　COX是花生四烯酸转化为前列腺素H2的限速酶，有2种异构体，即COX-1和COX-2。COX-1活性与各种生理功能有关;COX-2主要由各种细胞内和细胞外的刺激诱导产生，如细胞因子、生长因子、有丝分裂原以及其他炎症递质。国外多项大规模的流行病学研究发现，长期规律服用NSAIDs能使结肠癌发病的危险性降低，并能减少胃癌、食管癌的发病率和病死率[6]。Tatsuguchi等[7]通过体外研究发现，COX-2通过刺激血管生长因子抑制细胞凋亡而导致胃癌组织血管生成;同时检测107例术后胃癌组织标本COX-2、VEGF、PDGF、Bcl-2的表达，微血管密度及凋亡指数，发现COX-2与VEGF、PDGF呈明显正相关，后二者在进展期胃癌中高表达，而微血管密度在COX-2及VEGF阳性的病例中高表达;COX-2阳性病例的凋亡指数降低，提示COX-2通过刺激血管生成、抑制凋亡而参与了胃癌的发生发展。　　本研究应用COX-2抑制剂塞来昔布作用于SGC-7901人胃癌细胞后，再应用顺铂，不但明显抑制了胃癌细胞的生长，同时流式细胞学检测表明，作用48 h及72 h的凋亡细胞百分率明显增加，其作用呈时间依赖性及浓度依赖性。与塞来昔布组、DDP组及对照组相比，差异有统计学意义。以上结果提示，塞来昔布可显著增强胃癌细胞对顺铂诱导凋亡的敏感性。推测其机制为：1) 与塞来昔布作用后胃癌细胞出现G0/G1期阻滞有关。2)受凋亡相关基因的调控。Bcl-2是目前公认的凋亡抑制基因，其表达上调时细胞凋亡受抑制。对塞来昔布作用于胃癌细胞过程中Bcl-2蛋白的表达水平进行检测，结果显示，对照组呈较高水平的Bcl-2蛋白表达，药物作用后24 h， Bcl-2蛋白表达水平开始下降，随作用时间延长，其表达水平降低，表明塞来昔布作用于胃癌细胞后，细胞凋亡的变化与Bcl-2蛋白表达水平的变化趋势相一致。以上结果表明，塞来昔布联合顺铂诱导人胃癌细胞凋亡，与抑制Bcl-2蛋白水平有关。这可能是COX-2抑制剂体外抗肿瘤的机制之一。【参考文献】  　[1] Rodrigues S, Bruyneel E, Rodrigue CM, et al. 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