Cajal间质细胞在先天性巨结肠分布的研究
发表时间：2010-02-25 浏览次数：694次
Cajal间质细胞在先天性巨结肠分布的研究作者：高颖 曲政 王磊 陈新国 古立暖 王加勇 作者单位：1济南市医学会 2 济宁医学院 3济南市中心医院 普外科 4山东省立医院 小儿外科 5山东大学齐鲁医院 普外科 【摘要】 目的：通过观察cajal间质细胞（interstitial cells of cajal，ICC）在正常结肠及先天性巨结肠先天性巨结肠（hirschsprung's disease，HD）患者痉挛段、移行段、扩张段的分布，探讨HD的发病机制。方法:收集25例HD患儿标本，于术中分别选取扩张段、移行段、痉挛段肠壁的全层组织，另取6例手术患儿的正常结肠全层组织标本，常规固定石蜡包埋组织切片备用。对标本行c-Kit免疫组织化学染色。光镜观察ICC的分布，计数并进行统计学分析。结果:正常结肠ICC主要分布在环肌内侧面与黏膜下层之间即黏膜下ICC（submucosal ICC,ICC-SM）、环肌与纵肌之间的肌间神经从周围即肌间ICC（myenteric ICC，ICC-MY）以及环肌与纵肌内。HD患儿痉挛段ICC-SM、ICC-IM细胞数较扩张段和正常对照组明显减少(P＜0.01)，且ICC的细胞突起的分支亦减少，彼此之间不能形成完整的细胞网络。而扩张段ICC与正常对照组比较无明显差异(P＞0.05)。结论:HD患儿结肠ICC的异常分布，可能是HD发病、肠管蠕动障碍以及排便异常的原因之一。 【关键词】 先天性巨结肠·Cajal间质细胞·免疫组织化学 Immunohistochemical study on interstitial cells of cajal in Hirschsprung’s disease GAO Ying1， QU Zheng2， WANG Lei3， CHEN Xin-guo4， GU Lin-uan4， WANG Jia-yong5l Jinan Institute of Medicine（Jinan 250000 China）2 Jining Medical College（Jining 272013 China） 3 Department of General Surgery of Jinan Central Hospital （Jinan 250012 China） 4 Pediatric Surgery of Shandong Provincial Hospital （Jinan 250021 China）5 Department of General Surgery, Qilu Hospital of Shandong University （Jinan 250012 China） 【ABSTRACT】 Objective：To investigate the role of interstitial cells of cajal （ICC） in the pathogenesis of HD through observing the distribution of the cells in normal colon and HD's different segments. Methods: The aganglionic、transitional and dilated segments were collected in operations from 25 children with Hirschsprung’s disease. Another 6 normal segmengts were also collected. Each sections was stained by c-Kit immunohistochemistry. The distribution of the interstitial cells of Cajal was observed by light microscope. Results: The ICC in aganglionic segments of colon from Hirchsprung’s disease were decreased significantly and statistically than that in dilated and normal colon. Moreover, whole mount preparations showed that, not only the number of ICC-IM was decreased down, but also the branches of ICC-IM and the cellular network were also broken down. Conclusion: The pathogenesis of HD is related to the abnormal distribution of ICC，which lead to or aggravate the bowel spasm in HD. 【KEY WORDS】 Hirschsprung’s disease·Interstitial cells of Cajal·Immunohistochemistry 先天性巨结肠（Hirschsprung’s disease, HD）是小儿普通外科常见病，由于病变肠段神经节细胞缺如，平滑肌过度收缩呈痉挛状态，蠕动消失，肠腔内粪便不能通过痉挛部位，近端结肠继发性扩张，形成巨结肠，临床上出现肠梗阻或便秘症状。 1893年西班牙神经解剖学家Cajal采用甲基蓝及嗜银染色法发现了存在于胃肠道的一种特殊类型的细胞, 被称为Cajal间质细胞（interstitial cells of Cajal，ICC）。ICC是胃肠道运动的起搏细胞，具有自发性电活动和产生传播慢波等功能，对胃肠道运动具有非常重要的调节作用。ICC的变化与多种胃肠动力疾病有关。本研究通过c-Kit免疫组织化学染色，光镜观察ICC在正常结肠和巨结肠患者扩张段、移行段、痉挛段的分布，探讨ICC在HD致病中的作用。1 资料与方法 1.1 一般资料 收集山东省立医院、山东大学齐鲁医院2005年5月～2007年10月25例HD患儿手术切除组织，其中男22例，女3例。平均年龄23个月，2周～3个月4例，3个月～3岁16例，>3岁5例。长段型2例，短段型2例，其余均为普通型。所有病例综合临床表现、X线钡剂灌肠和手术所见，并经术中冰冻术后病理组织学检查确诊为HD，病例资料完整，均为散发。手术切除的扩张段、移行段、痉挛段全层肠壁组织经4%甲醛固定，常规石蜡包埋切片，以扩张段组织蜡块作自身对照。另取6例正常结肠组织作为对照，其中3例为乙状结肠冗长症患儿切除的部分结肠组织，2例为肠扭转肠坏死患儿切除的部分升结肠组织，1例为回盲型肠套叠患儿手术切除组织。 1.2 主要试剂和方法 兔抗人c-Kit多克隆抗体IgG，购自上海长岛生物抗体有限公司；SP免疫组织化学染色试剂盒，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。 组织蜡块行SP法免疫组织化学染色。每个蜡块连续切片3张，厚3～4 μm；切片常规脱蜡至水；3%过氧化氢去离子水室温孵育5～10 min；蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min，微波抗原修复。正常山羊血清工作液封闭，室温孵育10 min，倾去血清，勿洗；滴加1:50稀释的一抗，37 ℃孵育2 h；PBS冲洗3次 ；滴加生物素标记羊抗兔IgG二抗工作液，37 ℃孵育15 min；PBS冲洗3次。滴加PBS稀释的辣根酶标记链霉卵白素工作液, 37 ℃孵育15 min；PBS冲洗3 min，共3次；DAB显色，苏木精复染，封片。以试剂盒附送阳性片作为阳性对照，以PBS液代替一抗作为阴性对照。 1.3 观察指标 由有经验的病理医师在高倍镜（×400）下观察全部病理切片的肌间、黏膜下各10个视野，了解ICC的分布情况并计数。 1.4 统计学处理 全部数据经SPSS 13.0统计软件分析。HD扩张段、痉挛段与对照组行成组设计两样本均数比较的t检验，扩张段与痉挛段之间行配对设计资料t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。2 结果 2.1 不同结肠组织内ICC的分布 正常结肠组织内可见两类c-Kit阳性细胞：一类细胞胞体较大，呈圆形，主要分布于黏膜层和黏膜下层，在肌层内和浆膜下分布稀少，根据形态可识别为肥大细胞（图1）。另一类细胞胞体较小，呈梭形或多角形；细胞质相对较多，可见棕色颗粒；核呈深蓝色，圆形或椭圆形，此为ICC。ICC细胞主要为多极细胞，少数为双极细胞，细胞有2～3个细长突起，彼此借突起相互连接。分布在纵肌与环肌之间的肌间神经从周围的ICC称之为肌间ICC（myenteric ICC, ICC-MY)，细胞借突起形成网络状结构；位于黏膜下环形肌层表面的ICC称之为黏膜下ICC（submucosal ICC , ICC-SM)，细胞多为双极细胞，借突起相互连接于黏膜下层和环肌层形成明显的界面；分布在环肌、纵肌内的ICC称之为肌内ICC（intramuscular ICC , ICC-IM）,有的与平滑肌平行走行，有的与平滑肌交叉，数量较少，彼此之间未见相互连接（图2）。 ICC在HD患儿病变结肠各段的分布不同。扩张段病变结肠c-Kit阳性表达细胞数量和形态与正常结肠无明显差别，根据形态可识别肥大细胞和ICC。ICC主要为ICC-MY和ICC-SM，彼此之间相互连接形成网络状结构或形成一界面，ICC-IM数量较少（图3）。痉挛段病变结肠c-Kit阳性表达细胞明显减少,彼此之间的网络状结构被破坏，ICC-SM亦明显减少，彼此之间连接消失；ICC细胞形态与扩张段和正常结肠相似，仍呈梭形或多角形（图4）。移行段病变结肠c-Kit阳性表达细胞数量介于扩张段与痉挛段之间。 2.2 不同结肠组织内ICC数量的比较 正常结肠组织、HD扩张段、HD痉挛段的ICC-MY数量分别为（13.17±2.17）、（11.12±3.28）、（2.16±1.70）；ICC-SM的数量分别为（6.56±1.18）、（8.33±2.16）、（1.88±1.56）。正常结肠组织与HD扩张段ICC-MY数量比较，差异无统计学意义（t=1.057 6,P=0.2990）； ICC-SM数量比较，差异亦无统计学意义（t=1.791 5, P=0.0837）。正常结肠组织ICC-MY和ICC-SM数量均多于HD痉挛段，差异有统计学意义（t=10.432 5, P＜0.01；t=8.443 3, P＜0.01）。HD扩张段ICC-MY和ICC-SM数量均多于痉挛段，差异有统计学意义（t= 9.316 5, P＜0.01；t= 9.778 3, P＜0.01）。3 讨论 HD是常见的小儿普通外科疾病，患儿胃肠道平滑肌过度收缩甚至痉挛，蠕动消失，肠腔内粪便滞留，近端结肠继发性扩张，形成巨结肠，临床上主要表现为肠梗阻或便秘症状。ICC是胃肠道运动的起搏细胞，对胃肠道运动具有非常重要调节作用。HD患儿多伴有病变结肠组织ICC的缺如。既往应用甲基蓝和嗜银染色、金属掺合剂、NADPH—黄递酶染色以及碘化锌—四氧化锇酸法对ICC进行检测，但这些方法均缺乏特异性。真正的检测依赖于显微镜，这在一定时期内限制了对ICC的研究。ICC的基因表达产物c-Kit 可以作为一种化学标志物与其他细胞区别开。c-Kit是酪氨酸激酶受体，具有细胞外、细胞膜和细胞质内3个部分［１］。细胞外的部分为肝细胞因子（stem cell factor，SCF）的受体区,细胞内部分为酪氨酸激酶区。SCF与c-Kit结合活化了酪氨酸激酶,导致一系列磷酸化过程,从而影响细胞的生长和分化。人类肠道组织中c-Kit免疫组织化学染色仅能标记两种细胞，即肥大细胞和ICC。 本研究发现，正常结肠组织内c-Kit阳性细胞有较高的表达率，主要分布于肌间和黏膜下，密度明显高于环肌与纵肌内。通过形态可以区别肥大细胞和ICC，肥大细胞较大呈圆形，具有圆形的细胞核，细胞质丰富。ICC呈梭形，多为多极细胞，少数为双极细胞，具有卵圆形细胞核。位于肌间的ICC彼此借突起相互形成网络状结构，黏膜下的ICC连接形成一明显的界面。 胃肠运动依赖神经元、ICC和平滑肌细胞的正常功能。ICC产生的基本电节律起关键作用。ICC是胃肠慢波活动的起搏器。Koh等［２］将在分离培养的Balb/c小鼠的小肠ICC上用膜片钳技术记录到了有节律性、规则的慢波样去极化波形，其波形与宽度均与胃肠道平滑肌肌条上记录的慢波相似。但小肠ICC与平滑肌细胞电生理特性不同，ICC在膜电位时即表现出自发性电压振荡（voltage oscillation），节律性电活动不被超极化和L-型钙通道阻滞剂所阻断；而平滑肌细胞无自发性电活动，仅表现为电压敏感性动作电位（voltage sensitive action potential），可被超极化和L-型钙通道阻滞剂抑制［３-４］。结肠肌层ICC细胞培养电生理研究发现，ICC属兴奋型细胞，有自发性节律性电活动，阈值明显低于平滑肌细胞，推测ICC为胃肠电活动的起搏细胞。ICC也是肠神经和平滑肌之间的中间媒介。研究表明，肠肌丛ICC与运动神经元相联系［５］。ICC通过与平滑肌细胞的电藕联关系，传递神经冲动。ICC也能释放某些神经递质，如神经肽，直接影响平滑肌细胞的相应受体。 ICC与神经节细胞关系密切。胚胎时期，ICC的分化和成熟需要c-Kit的配体，后者由神经元或其他细胞产生。本研究发现痉挛段肌间和黏膜下ICC数量较扩张段和正常结肠明显减少。尚不清楚是由于神经节细胞的减少引起了ICC的减少，或者相反，还是某种共同的因素导致了二者的同时减少。目前研究认为HD胚胎基质的某种缺陷不仅损害了神经节细胞的移行，也影响了ICC的分化和成熟，致使生后某段肠管神经节细胞缺如，同时病变肠管ICC数量和ICC网络异常，但具体的原因还不清楚。 刘浩等［６］研究c-Kit及SCF在儿童贲门失弛缓症的分布，发现在远端食道及胃底部，c-Kit样纺锤体型细胞的分布与对照组基本相同，但在贲门部明显稀疏或缺如。Watanabe等［７］研究发现，儿童贲门失弛缓症与食管下端括约肌（lower esophageal sphincter，LES）内的ICC接受抑制性氮能神经传导减少有关。慢性假性肠梗阻也被认为与ICC的减少有关。Jain等［８］发现慢性假性肠梗阻患者小肠壁c－Kit阳性ICC消失。慢传输型便秘的患者结肠ICC明显减少，细胞体积缩小，包括纵肌层ICC（ICC—longitudinal muscle，ICC－LM）、环肌层ICC（ICC—circular muscle，ICC－CM）等［９］。 本研究发现，在正常结肠组织和HD扩张段分布大量c-Kit阳性ICC，彼此间借细胞突起相连接，在肌间形成网络状结构，在黏膜下相互连接形成一明显的界面，在环纵肌内通过树状结构与肌细胞相连。ICC在神经丛内主要分布于外周，与平滑肌细胞紧密相连；在黏膜下边缘与神经丛伴行。HD无神经节细胞肠段肠壁内c-Kit阳性的ICC细胞数目明显减少。在痉挛段ICC形成的网络状结构不明显或消失，提示ICC之间及其与平滑肌细胞的电藕联遭到破坏。推测HD患儿ICC的正常功能遭到破坏，导致肠道运动功能紊乱，失去正常的蠕动功能，从而使大便排出受阻，发生远端肠管痉挛狭窄和肠梗阻。 然而HD是一种多病因疾病，很多问题不能用ICC缺如的单一因素解释。例如：HD术后已经切除至神经节细胞正常肠段，患儿为什么还存在小肠结肠炎、便秘、污粪等并发症？是否还存在其他发生机制是否涉及其他与肠道运动相关的因素？这些问题都有待于深入的研究。【参考文献】[1] Huizinga JD, Thuneberg L, Kluppel M, et al. 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