高剂量1318 nm Nd:YAG激光对体外胰腺癌细胞增殖的影响
发表时间：2009-10-16 浏览次数：759次
作者：刘建刚 刘志超 喻超 杨在富
【摘要】 目的：研究高剂量1 318 nm Nd:YAG激光的生物学效应。方法：用波长为1 318 nm的Nd:YAG激光连续照射体外培养的处于对数生长期的人胰腺癌PC-3细胞，分组分别照射0、10、15、20、25、35和50 s后，继续培养24 h，噻唑蓝比色法（MTT）测定各组吸光度（optical density,OD）值，研究细胞增殖情况。结果：照射剂量在122.3～407.6 J/cm2，随着激光照射剂量的提高，PC-3细胞的OD值逐渐降低，且照射15 s后差异有统计学意义（P<0.05）。结论：高剂量1 318 nm Nd:YAG激光对PC-3细胞具有抑制增殖的作用，且呈剂量依赖性。
【关键词】 Nd:YAG激光· 胰腺肿瘤·肿瘤细胞，培养的·比色法
Effect of high intensity 1318 nm Nd:YAG laser irradiation on human pancreatic carcinoma cell proliferation in vitro
LIU Jian-gang1 , LIU Zhi-chao2 , YU Chao3 ,YANG Zai-fu4
1Department of Surgical Generalization, 2Department of Dermatology, Jining Medical College （Jining 272013, China）
3Department of Hepato-Biliary Surgery, General Surgery, Affiliated Hospital of Guiyang Medical College （Guiyang 550001,China）
4 Institute of Radiollogical Medicine Research of Academy of Military Medical Sciences （Beijing 100850, China）
【ABSTRACT】 Objective: To investigate the biological effect of high intensity 1 318 nm Nd:YAG laser on human pancreatic carcinoma cell （PC-3） proliferation. Methods: Seven groups of PC-3 cells were cultured in 96-well plates for 12 h and then irradiated with 1318 nm Nd:YAG continuous wave laser at different intervals （0, 10, 15, 20, 25, 35, 50 s）. The laser power was 1.6W and spot diameter 5 mm （laser dose 0～407.6 J/cm2）. Cells were irradiated once and cultured for the next 24 h. MTT was used to assess the cell proliferation. Results: A significant stimulative effect of 1318 nm laser on PC-3 cell proliferation was found （P<0.05）. Conclusion: The PC-3 cell proliferation might be inhibited by high intensity 1 318 nm Nd:YAG continuous wave laser, which suggested that this laser could be beneficial to patients with pancreatic carcinoma.
【KEY WORDS】 Nd:YAG laser·Pancreatic neoplasm·Tumor cells, cultured·Colorimetry
自20 世纪70 年代激光首次应用于医学领域后，就显示出极高的应用价值和广阔的发展前景。激光治疗肿瘤，选择性强，患者痛苦小，严重不良反应少。临床常用的波长为1 064 nm Nd:YAG 激光，在治疗中晚期上消化道肿瘤及肝癌中已有报道［1～2］；波长为1 318 nm的Nd:YAG激光对肿瘤细胞生物学效应的研究还较少［3］。本课题组在前期研究中发现，低剂量（34.65～121.27 J/cm2）1 318 nm Nd:YAG激光能够促进人胰腺癌PC-3细胞的增殖［4］。本研究探讨高剂量1 318 nm Nd:YAG激光对人胰腺癌PC-3增殖的影响，为临床治疗提供基础理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要材料 牛血清白蛋白，噻唑蓝（MTT），二甲基亚砜（DMSO），锥虫蓝均购自美国Sigma公司；高糖DMEM培养基，购自美国Hyclone公司；胎牛血清由杭州四季青生物工程材料有限公司生产。CO2恒温培养箱，美国Baxter公司制造；Multiskan MK3型酶标仪，产地上海；多功能倒置显微镜日本Nikon公司生产；Nd:YAG激光器，中国科学院物理所提供；EP1000 D型激光功率能量计，军事医学科学院二所提供。胰腺癌PC-3细胞系，中国人民解放军302医院肝胆研究中心赠送。
1.2 方法
1.2.1 细胞准备 将胰腺癌PC-3细胞系加入含10%热灭活胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL 链霉素的高糖DMEM培养基上，置于37 ℃、5％ CO2的饱和湿度培养箱中传代培养，0.25%的胰酶消化。2～3 d传代1 次。
取处于对数生长期第4代的PC-3细胞经0.25%胰酶消化后，离心，高糖DMEM培养基混匀制成细胞悬液， 浓度为2.5×105 mL-1。按实验设计加入96孔培养板，每孔40 μL，任意2个有细胞的小孔间隔1个空白小孔，防止杂散激光干扰。所有加入细胞悬液的孔分为7组，每组6孔，各孔加入高糖DMEM培养基150 μL，放入37 ℃、 5% CO2培养箱培养12 h准备激光照射。
1.2.2 激光照射 如图1所示，光阑直径5 mm，7组细胞按照射时间分为0（对照组）、10、15、20、25、35和50 s组。实验开始前、照射过程中和结束后各测1次透过光阑的激光功率，取其平均值1.70 W（1.68～1.72 W）。计算得到激光照射剂量分别为0、81.5、122.3、163.0、203.8、285.4和407.6 J/cm2。照射1次后继续培养24 h，行细胞形态观察和MTT检测。
1.3 细胞形态观察 将96孔培养板置于倒置显微镜下，调节焦距观察细胞的形状并摄片。
1.4 MTT检测 向各孔加入5 mg/mL的MTT液20 μL，振荡，继续培养4 h，吸去培养基，加入DMSO，每孔150 μL，室温下微孔板震荡10 min，酶标仪波长492 nm处测定吸光度（optical density，OD）值。
1.5 统计学处理 采用成组设计t检验，应用SPSS 11.5软件包进行统计学分析，α=0.05为显著性检验水准。
2 结果
2.1 细胞的形态观察 倒置显微镜下可见实验组细胞密度明显低于对照组（图2）。
2.2 各组PC-3细胞OD值比较 除10 s组外，其余各组OD值与0 s组（对照组）相比，差异均有统计学意义（表1）。
3 讨论
Nd:YAG激光产生于20世纪60年代，是一种近红外激光，常用波长为1 064 nm，具有能量大、不易被水吸收、组织穿透力强、能由光导纤维传导等特点，广泛应用于腔内疾病的治疗。1 318 nm激光在血液中的穿透深度是1 064 nm激光的27倍，更加适用于切除深部或含血管丰富的各类肿瘤［5］。胰腺癌是临床上常见的消化系统肿瘤，起病隐匿，病程进展迅速，早期即可转移，手术根治性切除率低，且对放疗或化疗均不甚敏感［6-7］。激光作为一种靶向性和组织穿透性都较好的方法，成为治疗胰腺癌的新趋向。本研究通过观察高剂量1 318 nm Nd:YAG激光照射胰腺癌细胞后细胞的生长情况，探讨高剂量1 318 nm Nd:YAG激光对胰腺癌细胞的影响，为临床上Nd:YAG激光的应用提供理论依据。
本研究结果显示1 318 nm Nd:YAG激光在122.3～407.6 J/cm2范围内对人胰腺癌PC-3细胞的增殖有抑制作用（P <0.05或P <0.01），且随照射时间的延长、照射剂量的增大，逐渐增强。这主要与激光的热效应有关。激光照射局部组织，将光能转变为热能，组织吸收，温度升高。已有研究显示42～45 ℃高温可影响生物膜的功能和结构，激活溶酶体活性，抑制DNA、RNA 和蛋白质的合成，增加热休克蛋白合成，从而杀死肿瘤细胞［8］。此外，激光还能增强机体免疫，增强照射局部的免疫反应，产生免疫抗体，杀灭肿瘤细胞［9］。因此，Nd:YAG激光对人胰腺癌PC-3细胞增殖的抑制作用还可能与激光的免疫效应有关。
本研究结果提示，1 318 nm Nd:YAG激光在一定剂量范围（122.3～407.6 J/cm2）有抑制胰腺癌PC-3细胞生长的作用。研究1 318 nm Nd:YAG激光对处于不同增殖状态、不同细胞周期时相以及实验动物肿瘤细胞的生物效应是本课题组下一步工作的方向。
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