泛素蛋白酶体系统功能障碍与帕金森病

泛素蛋白酶体系统功能障碍与帕金森病作者：谭玉燕,周海燕,陈生弟    作者单位：200025上海交通大学医学院附属瑞金医院神经内科 　　遗传因素在帕金森病（PD）的发病中占重要地位。已经发现asynuclein、Parkin、UCHL1、DJ1、Nuur1、PINK1、LRRK2等基因突变与家族性PD有关。随着越来越多的PD致病基因的发现，研究者们开始怀疑：PD是一个单独的疾病实体还是一组有相似临床表现但具有不同病理生理过程的疾病群？然而在asynuclein、UCHL1、Parkin、DJ1等蛋白的功能被逐渐认识后，由泛素（ubiquitin）介导的蛋白降解途径的功能受损被认为可能是PD发病的共同分子机制，这种途径即是泛素蛋白酶体途径（UPP）。泛素蛋白酶体系统（UPS）可选择性地降解细胞内的蛋白质，是一条重要的非溶酶体降解途径，它在多种与细胞周期性增殖及凋亡相关蛋白的降解中发挥重要作用。在许多神经系统变性疾病患者脑组织中，同样也发现有蛋白聚集体，这些聚集体通常含有泛素化的蛋白和UPS组分。这进一步证明了UPS在神经变性疾病发病中的重要作用。现重点阐述UPS在PD发病中的作用。1  UPS的组成　　UPS由两组重要的功能酶组成。一组是将靶蛋白泛素化，包括泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）和泛素连接酶（E3）。E1在ATP作用下，激活泛素分子并将其转移给E2形成E2泛素复合体，E3识别靶蛋白，E2泛素复合体将泛素分子通过E3转接或直接结合到靶蛋白的赖氨酸残基（lys）上，以上过程可以重复进行，形成多聚泛素链。另一组是去泛素化酶（DUB），包括泛素羧基末端水解酶（UCH）和泛素专一蛋白酶（UBPs）两大家族。前者主要水解与靶蛋白结合的或者游离的多聚泛素链，后者水解单个泛素分子与蛋白结合的肽键或者两个泛素分子间的肽键，水解成的游离单个泛素分子可以循环利用。多聚泛素链标记的靶蛋白最终被26S蛋白酶体识别降解。26S蛋白酶体是真核细胞内ATP依赖的由多个亚单位组成的蛋白降解系统，有多种催化酶降解活性，包括一个中心催化器（CP），即20S蛋白酶体，和两个调节亚单位(RP)，被命名为PA700（或19S）,两个RP分别连接到CP的末端，组装成有活性的降解系统。CP是一个桶状的结构，由28个亚单位α7β7β7α7按顺序纵向堆积组成两个β内环和两个α外环，每个β内环的3个β亚单位（β1 β2 β3）有多种酶催化功能。这些β亚单位是整个系统的催化核心，位于两个β内环的内表面，因此靶蛋白必须经过由两个α外环组成的狭窄“入口”。PA700由基底复合体和顶盖复合体组成。基底复合体靠近20S蛋白酶体，有6个ATP酶位点和2个调解部分，在ATP供能时能与20S蛋白酶体的α外环结合，使“入口”打开，同时使靶蛋白伸展，协助其进入催化位点。顶盖复合体离20S蛋白酶体较远，含有多个非ATP酶的亚单位，主要作用是识别靶蛋白、去泛素化、与E3等蛋白相互作用。2  UPS与路易小体    PD的病理性标志是路易小体（LB），最初在散发性PD中发现。它是一种嗜酸性蛋白包涵体，由一个致密核心和周围的纤维晕组成。核心主要由脂质构成，而周围的纤维晕主要由纤维丝和多种未被降解的蛋白形成，主要的蛋白成分包括asynuclein、泛素、蛋白酶体亚单位、UCHL1、Parkin等。虽然LB被发现已有数十年，但它的形成机制和病理意义（毒性作用还是保护机制？）并不十分明确。当异常、突变、氧化修饰的蛋白超过了细胞的降解能力或者UPS本身功能受损都可以导致这些蛋白聚集，而聚集体内成分asynuclein过量表达或突变也能削弱UPS的功能，因此UPS功能丢失可导致蛋白聚集，反过来聚集体又可以损害UPS功能，形成恶性反馈循环。故在LB的病理意义上，目前较认可的观点是：初期LB将这些毒性蛋白隔离包裹起来，是对细胞的一种保护作用,但是当过量的毒性蛋白堆积时，会触发恶性反馈循环，对细胞造成毒性损害。3  UPS与家族性PD    除了细胞内包涵体外，提示UPS与PD发病有关的更有力证据是家族性PD致病基因的发现。对这些基因的研究让我们对散发性PD的发病机制有了更进一步的了解。asynuclein 、Parkin、 UCHL1、DJ1等基因突变已确认与家族性PD有关，而且它们都指向同一种分子机制，即它们直接或间接地与UPS有关。　　3.1  asynuclein  asynuclein是一种突触前蛋白，具体的生理功能还不清楚。野生型asynuclein是单体型，当过量表达时可聚集形成纤维丝。它的两种突变A53T、A30P能导致常染色体显性遗传性PD。体外实验证明asynuclein可以通过UPS降解，抑制UPS会导致泛素化asynuclein的聚集。野生型和A53T突变型asynuclein都可以被UPS降解，但是后者的降解速度明显变慢。进一步的实验证明，过量表达野生型或者突变型asynuclein会削弱UPS的功能，而且使神经元对蛋白酶体抑制剂和线粒体依赖性的凋亡更敏感，这其中可能的分子机制是：野生型asynuclein能与26S蛋白酶体的调节亚单位PA700的亚基Tat结合蛋白1（TBP1）相互作用，增强PA700对蛋白酶体的活化，而突变型asynuclein或过表达野生型asynuclein会削弱这种活化、降低蛋白酶体的活性［1］，从而减弱细胞对蛋白酶体抑制剂的耐受性，导致线粒体损害和细胞凋亡［2］。也有研究证明，硝基化的asynuclein能促进未被修饰的asynuclein形成纤维丝，后者难以被UPS降解，且能抑制UPS的功能。但是目前还不能确定asynuclein在生理状态下是否被UPS降解，因为其泛素依赖和非依赖的更新途径都有报道，除了UPS，还可以通过溶酶体、自我吞噬和胞浆内酶，如Calpain Ⅰ降解。　　3.2  Parkin  Parkin基因突变是1998年在日本常染色体隐性遗传少年型PD(ARJP)患者中发现的，此后的研究发现约50%的早发性PD存在Parkin基因突变，包括多种点突变和缺失突变。Parkin是一个由465个氨基酸残基组成的蛋白，其氨基端有泛素样结构域（UBL）、羧基端有两个环指模序(Ring figure motif)。迄今为止发现的大多数点突变发生在环指模序中，提示这是重要的功能域。Parkin具有泛素连接酶（E3）功能，研究发现，它能与泛素结合酶（E2）UbcH7和UbcH8相互作用，促进底物泛素化。在泛素化过程中，环指模序促进E2组分的循环再利用，而UBL结构域在协助泛素化靶蛋白转运至26S蛋白酶体的过程中发挥作用。环指模序部位突变，Parkin不能与UbcH7和UbcH8相互作用，阻碍了泛素化，使靶蛋白堆积，对细胞产生毒性。故一个重要问题即是找到Parkin作用的底物，已确认的包括：突触囊泡相关蛋白CDCrel1、Parkin相关内皮受体样受体PaelR、22KD的糖基化asynuclein、synphilin1等。Parkin突变会影响CDCrel1对多巴胺释放的调节。PaelR在含有酪氨酸羟化酶的细胞内高水平表达，过表达会形成错误折叠的蛋白在细胞内沉积，通过未折叠蛋白应激（UPR）诱导细胞死亡；在ARJP患者中，黑质多巴胺神经元内有不溶性PaelR的聚集。Parkin促进PaelR的泛素化降解，共表达Parkin和PaelR能减少UPR造成的细胞死亡。asynuclein的一种22KD糖基化的形式和synphilin1确认是Parkin的底物，而且过表达Parkin可以缓解突变asynuclein和UPS抑制剂的毒性。这些发现表明Parkin基因突变使UPS清除异常蛋白质的功能受损，蛋白积聚可导致多巴胺神经元死亡。也有报道Parkin能直接与蛋白酶体的亚单位相互作用，从而影响其功能［3］，但是敲除Parkin基因的小鼠并没有发现Parkin底物的聚集，使人们不得不怀疑这些底物被UPS降解时Parkin究竟发挥多大作用。但也有人认为Parkin活性下降影响UPS对底物的泛素化，而蛋白的泛素化是LB形成的必要条件。缺乏LB的保护作用可能是ARJP早发的原因。　　3.3  UCHL1  UCHL1是一种重要的泛素羧基末端水解酶，1998年Leroy等在一个德国家系中发现UCHL1的I93M突变，呈常染色体显性遗传。UCHL1主要有3种功能：（1）水解功能，主要水解以lys48方式连接的多聚泛素链，使泛素分子循环利用，I93M突变的UCHL1水解功能下降50％，其活性下降影响异常蛋白质的清除，这可能是神经元变性的原因之一。但是UCHL1的异构体UCHL3的水解功能远远强于UCHL1，理论上UCHL3可以代偿UCHL1活性降低对UPS的损伤，提示UCHL1的水解功能可能在PD发病中不起主导作用；（2）非ATP依赖的lys63泛素连接酶功能，该连接方式不会被26S蛋白酶体识别降解，容易使蛋白聚集［4］。研究发现UCHL1的18位残基并不是保守的，而是存在一个S18Y的多态性，这种多态性具有保护作用，能降低PD的发病率。相应的理论依据是：底物蛋白的63位赖氨酸残基上的泛素化链不能被26S蛋白酶体识别降解，故容易聚集在细胞内产生毒性，Liu等［4］用asynuclein作为底物，证明了S18Y的这种lys63泛素连接功能下降，而野生型和突变型（I93M）的这种连接功能没有明显区别，所以S18Y有可能通过这种机制发挥其保护作用；（3）稳定单个泛素分子的水平，调节其在细胞内的降解。靶蛋白的泛素化需要一定的泛素分子水平，如果泛素分子被过量降解，则会影响泛素化。而UCHL1能通过调节泛素分子的降解稳定其水平，而突变的UCHL1则没有这种功能。　　3.4  DJ1  DJ1基因是新近确认的一个与常染色体隐性遗传性早发性PD有关的基因［5］。它编码的DJ1蛋白由189个氨基酸残基组成，功能还不很明确。DJ1与细菌热休克蛋白HSP31同源，提示它可能通过与未折叠蛋白中间体相互作用从而降低蛋白的错误折叠。另有研究显示，DJ1具有抗氧化作用，能够保护或挽救被氧化应激损伤的蛋白。DJ1的功能可能是通过小泛素样修饰蛋白（SUMO）调节的。引起早发性PD是DJ1的L166p突变，早期的研究提示这种突变仍保持活性，只是比野生型DJ1更容易被UPS系统识别降解。在这个过程中，UPS可能因为过度清除了这种仍有活性的突变蛋白而参与了该疾病的发病机制。4  UPS与散发性PD    越来越多的证据表明UPS与散发性PD也有关，且与散发性PD的主要致病途径——氧化应激、线粒体功能障碍之间有着千丝万缕的联系。随着年龄的增长，越来越多的氧化损伤蛋白倾向于聚集，而UPS清除这些蛋白的能力下降可能是散发性PD发病的一个广泛基础机制。散发性PD患者中脑黑质中UPS的3种主要酶E1、E2、E3活性有明显下降，与线粒体复合物Ⅰ的活性下降相一致；PD患者黑质部位20S中心催化器的α亚单位有缺失，26S蛋白酶体的催化活性明显下降，其两个调节复合体19S/PA700调节效率也明显下降。散发性PD患者残存神经元内LB为大量未被降解的错误折叠或氧化修饰的蛋白，这些蛋白不易被UPS降解。其中LB的主要成分为asynuclein，有研究表明，线粒体损害产生氧化应激，氧化应激引起asynuclein的过量表达和酪氨酸硝化，超过了UPS的降解能力或者交联形成二聚体不易被降解。通过对UPS的底物和组分的研究，有学者提出一个较普遍的致病机制，该机制认为蛋白水解应激和蛋白清除障碍是关键，而富含多巴胺的神经元对此更易感，原因在于多巴胺的自身氧化使得氧化损伤的蛋白增多。5  UPS与PD动物模型　　前面已经述及，PD患者有UPS功能受损。但是这种损害是原发性还是继发性改变还不甚明了。6羟基多巴（6OHDA）或MPTP处理的PD动物模型出现选择性黑质纹状体神经元凋亡，MPTP处理后有asynuclein水平升高，缓慢持续注射MPTP可形成包涵体［6］，Zeng等［7］研究发现用MPTP处理一种叫狨的动物，能降低蛋白酶体的功能，亦降低蛋白酶体结构和调节亚单位的表达。给小鼠注射除草剂百草枯可导致asynuclein水平升高并形成包涵体［8］，但是它对黑质纹状体神经元选择性损伤不明显。目前为止还没有对这些动物模型中UPS的损伤进行深入研究。　　在大鼠，线粒体复合物Ⅰ特异性抑制剂鱼藤酮诱导选择性多巴胺能神经元变性坏死、形成富含asynuclein的胞浆包涵体，与PD的病理特征相符合。给予鱼藤酮，线粒体复合物Ⅰ受抑制，ATP水平下降，asynuclein蛋白聚集，去除鱼藤酮后，随着ATP水平恢复，细胞内asynuclein聚集消失，蛋白酶体的抑制剂可阻止这一反应。为了进一步了解UPS与PD发病机制之间的关系，研究者检测了鱼藤酮大鼠模型大脑皮质、纹状体和腹侧中脑（VBM）区域的20S蛋白酶体的功能，结果发现在VBM区域有明显的功能降低，且泛素连接的靶蛋白在该区域也相应显著升高。UPS功能损伤可能是由于线粒体受抑制，不能提供足量ATP或者产生大量自由基氧化损伤，包括UPS的蛋白亚基在内的蛋白。体外实验证实，鱼藤酮处理的中脑原代细胞内UPS功能受损主要是由于ATP的大量减少。然而，慢性接触低剂量鱼藤酮，对ATP生成影响较小，却能显著提高自由基的水平，这时神经元的凋亡可能是自由基发挥主要作用。另有实验证明，用鱼藤酮抑制神经母细胞瘤SHSY5Y的线粒体复合物Ⅰ，引起包括UPS各组分的蛋白氧化修饰。E1通过硫酯键与泛素结合，E1含巯基的活性位点被氧化，可抑制E1的活性。同时氧化应激使谷胱甘肽水平降低，后者又可降低E1活性，抑制蛋白泛素化反应。因此，线粒体抑制、氧化应激，可损害UPS，最终导致神经元变性死亡。注射神经毒素的PD模型在研究散发性PD的发病机制及治疗中发挥了重要作用，但是在PD的病理生理发生发展过程的研究中却存在很大的局限性。而根据家族性PD的突变基因制造的转基因或基因敲除小鼠和果蝇模型能为PD的深入研究提供更好的平台。转基因的小鼠过表达野生型或突变型asynuclein可出现PD的一系列特征性症状，如多巴胺能神经元变性、富含asynuclein和泛素分子的细胞内包涵体形成、运动症状等。但与PD不太符合的是：这些包涵体中没有纤维丝,在细胞核内也出现类似包涵体。在过表达Parkin的果蝇模型中，它能保护过表达asynuclein、PaelR诱导的多巴胺能神经元的选择性丢失。在过表达asynuclein的果蝇动物模型中，Parkin过表达能大量减少asynuclein阳性包涵体的数目。虽然Parkin敲除小鼠并没有出现预想中的底物聚集体，但是蛋白组化研究发现，一些参与线粒体氧化磷酸化和保护中脑腹侧神经元免受氧化应激损伤的蛋白水平下降。这提示Parkin可能在调节线粒体的正常功能中发挥作用。在Parkin敲除的小鼠和果蝇模型中检测到线粒体功能障碍和氧化应激增强［9］，而没有出现明显的多巴胺能神经元死亡,提示在ARJP患者，可能首先出现线粒体功能损伤，继而触发多巴胺能神经元的死亡。Parkin的底物范围很广，有较大的对抗各种毒性应激的能力，提示其可能通过线粒体保护、UPS保护等多种途径发挥作用。    总之，相当多证据证明UPS功能损伤在PD发病机制中发挥作用。家族性PD的致病基因多直接或间接与UPS有关；散发性PD有asynuclein的聚集、线粒体功能障碍、氧化应激和UPS受损；PD的动物和细胞模型证明氧化应激和asynuclein的过表达会降低UPS的功能，且UPS的抑制剂可以导致asynuclein的聚集。对UPS调节及其损伤后功能改变的进一步研究可能会给PD的治疗开拓新的途径。【参考文献】　　［1］Lindersson E, Beedholm R, Hojrup P, et al. 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