反义雷帕霉素靶蛋白基因局部转染对移植静脉内膜增生的影响

反义雷帕霉素靶蛋白基因局部转染对移植静脉内膜增生的影响

(胡新华,张强,杨军,刘程伟)

中国医科大学附属第一医院  血管外科  （辽宁  沈阳  110001）      【关键词】  雷帕霉素靶蛋白 基因转移,水平 内皮,血管 静脉 移植,自体 纳米粒子

　【摘要】目的：观察以纳米粒子为载体的反义雷帕霉素靶蛋白（mTOR）基因局部转染对移植静脉内膜增生的影响。方法：应用聚乳酸聚乙醇酸共聚物（PLGA）和聚乙烯醇（PVA）包载mTOR基因，制备纳米级粒子混合物。检测其包埋率、体外释放情况及粒子大小。建立自体静脉移植模型，随机分成转基因组、空载体组、对照组。转基因组移植静脉转染以纳米粒子为载体的反义mTOR基因，空载体组单纯转染纳米粒子包载的空载体，对照组不予特殊处理。分别于术后3d、7d、14d、28d取材，常规HE、Verhoeff染色，RTPCR、Western blot检测mTOR基因的mRNA及蛋白的变化，TUNEL法观察血管平滑肌细胞（VSMC）凋亡的动态变化。结果：转基因组内膜中mTOR基因的mRNA及蛋白产物表达较其他两组明显减少（P＜0.05）；转基因组内膜增生厚度7d、14d、28d较其他组明显减少（P＜0.01）；转基因组凋亡细胞较其他组明显增高（P＜0.05）。结论：纳米粒子可以作为转基因载体，反义mTOR基因的表达能够有效抑制自体移植静脉内膜的增生，促进VSMC的凋亡。

    【关键词】雷帕霉素靶蛋白?基因转移，水平?内皮，血管?静脉?移植，自体?纳米粒子

       The effect of antisense mammalian target of rapamycin gene transfection on neointimal formation in vein graft in rats

    HU Xinhua,ZHANG Qiang,YANG Jun,LIU Chengwei,ZHANG Zhishen,YANG Dehua

    Department of Vascular Surgery,the First Affiliated Hospital,China Medical University (Shenyang 110001,China)

    【ABSTRACT】Objective:To study the effect of antisense mammalian target of rapamycin(mTOR)gene transfection mediated by nanoparticles (NP)on neointimal formation in rat vein grafts.Methods:Nanoparticle antisense mTOR gene complex was prepared with PLGA package.The efficiency,release process in vitro and size of the complex were determined.Autogenous vein graft model was established in 72 rats by transplanting internal branch of jugular vein to carotid artery.Three groups were studied:(1)antisense mTOR group:antisense mTOR gene mediated by NP were transfected into the veins before anastomosis.(2)Empty vector group:the vein were transfected by empty vector mediated by NP.(3)Control group(no transfection).The grafted veins were harvested 3 day,1 week,2 week and 4 week after the operation respectively.The exogenous mTOR mRNA and protein expression were determined by RTPCR and Western blot.Intimal hyperplasia(IH) were observed by HE and Verhoeff stain.The presence of apoptotic VSMC was detected by TUNEL stain.Results:Antisense mTOR gene transfection mediated by nanoparticle complex enabled to inhibit the mRNA and protein expression of mTOR gene(P＜0.05),and the IH was inhibited in the vein graft especially during 7d~28d(P＜0.01).Conclusion:Nanoparticle is an effective gene transfecting carrier,and antisense mTOR gene expression can prevent the IH and promote apoptosis after vein grafting.

    【KEY WORDS】Veins ?mTOR?Gene transfer,horizontal?Transplantation,autologous?Nanoparticle?Endothelium,vascular    

　利用自体静脉行冠状动脉搭桥或肢体旁路转流手术，是目前挽救病人生命和肢体功能的重要手段。但是，血管移植后狭窄、闭塞使手术远期失败率高达40%~60%。哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）作为一种重要的信号传导分子，参与细胞的多种生理和病理过程，在细胞的生存、生长及增殖过程中起中心调控作用［1］。我们已经成功构建mTOR基因的反义RNA真核质粒表达载体［2］。本研究中，我们以纳米粒子为载体局部转染反义mTOR基因，观察其对移植血管内膜增生的影响。

    1  材料与方法

    1.1  实验材料  Wistar大鼠72只，雌雄不拘，体重250~300g。重组质粒pEGPClmTOR为我们自行构建。聚乳酸聚乙醇酸（PLGA）、聚乙烯醇（PVA）由中国医学科学院生物工程研究所提供。TUNEL法凋亡检测试剂盒为武汉博士德公司产品。mTOR多克隆抗体为Santa Cruz公司产品。

    1.2  纳米微粒包载反义mTOR基因DNA质粒  将反义mTOR基因pEGPClmTOR质粒加入适量PLGA二氯甲烷溶液中，在冰浴条件下用高速搅拌器进行乳化，形成油包水型乳液后，再加入PVA水溶液，搅拌形成均一的水包油包水乳液，于通风橱内常压下搅拌挥发有机溶剂2h，高速离心机离心20min，收集沉淀，水洗除掉游离的基因及PVA后，冷冻干燥。

    1.3  纳米粒子粒径及分布的测定  采用激光子相关光谱仪（PCS美国Brookhaven公司），BI9000AT相关器，BI200SM光度计，Innova304氩离子激光器（美国Coherent公司）于25±0.1℃，进行激光光散射的测定。纳米粒子表面形态的观察：将包装了pEGPClmTOR质粒DNA的纳米粒子溶于蒸馏水中，滴加于盖玻片上，自然干燥，喷金扫描。

    1.4  载基因纳米粒子体外释放试验  称量含pEGPClmTOR质粒DNA的纳米粒子15.5mg,加入TE溶液中制成均一的悬浮液，将其放入双室扩散池的一侧，两池之间用0.22的滤膜隔开，另一侧为接收池，存放等体积新鲜的TE释放液，将此双室扩散池置于37℃130min的恒温摇床中进行释放实验，每24h用新鲜缓冲液更换接收池中的释放液，更换出的样品直接用紫外分光光度计在波长260nm处测定吸光值，计算出释放量绘制累积释放曲线。

  1.5  实验动物分组及局部基因定位转染  72只大鼠，随机分成转基因组、空载体组、对照组。转基因组：移植静脉转染以纳米粒子为载体的pEGPClmTOR质粒。空载体组：转染纳米粒子包载的pEGPCl空质粒载体。对照组：不予特殊处理。每组24只，分别于术后3d、7d、14d、28d取材。建立大鼠自体静脉移植模型：应用显微外科技术，取颈总静脉内侧支5mm，转基因组将移植静脉段置于已准备好的DNA溶液（称量DNA纳米粒子6mg，加入生理盐水0.3ml，制成均一的悬浮液）中30min后取出静脉，切断同侧颈总动脉，应用110无创缝合线将静脉段端端吻合于同侧颈总动脉；空载体组使用纳米粒子包载的pEGPCl空质粒；对照组使用生理盐水。各组动物分别于规定时间切取移植静脉段，液氮中冻存。

    1.6  形态学研究  参照文献［3］，取部分标本于10%中性福尔马林液固定过夜。石蜡包埋后切片，作HE染色、Verhoeff弹力纤维染色。TUNEL法检测VSMC凋亡。计算机图像分析仪分析Verhoeff切片，测量内膜厚度；分析TUNEL，计算阳性细胞百分率。

    1.7  RTPCR检测反义mTOR基因的整合  根据反义mTOR序列设计引物：F：5’AGGCCTTG GTGAGAGCTGTA3’，R：5’GGCACACATTTGAAGAAGCA3’，产物长度322bp；βactin F：5’TTCTGACCCATACCCACCAT3’，R：5’ATTACAGTGCGTGCTAAAGG3’，产物长度508bp。各取约100mg组织，按Trizol试剂盒说明提取总RNA，逆转录为cDNA。PCR过程：20μL反应体系，TaqDNA聚合酶0.5U，引物各50pmol。PCR反应条件：94℃变性2min后，94℃30s、56℃45s、72℃45s顺序共循环30次，最后72℃延伸7min。电泳，凝胶成像系统上摄像并分析各条带光密度值（基因表达值=mTOR/βactin）。

    1.8  Western blot检测mTOR蛋白的表达  取组织加裂解液，匀浆，16000×g，4℃离心20min，取上清，测蛋白浓度；以50μg上样，经10%SDS聚丙酰胺凝胶电泳后，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭，与mTOR多克隆抗体结合1h，再与二抗结合30min后显影，凝胶成像仪分析结果。

    1.9  统计学方法  组内差异采用方差分析，组间比较采用t检验。

    2  结  果

    2.1  纳米粒子粒度的测定  光散射粒度分布图可以看出，制备的载pEGPClmTOR质粒DNA纳米粒子的粒度集中分布在243~343nm，平均粒度为288.9nm。粒径呈窄分布，粒径大小稳定可靠，包封效率为60%，用紫外分光光度计测得DNA含量为3%。粒子的体外释放开始阶段存在爆破释放，约1周后释放量开始稳定，释放曲线缓慢上升，平稳维持释放18d以上（图1）。纳米粒子扫描电镜测定：电镜扫描观察载反义mTOR的纳米粒子，其直径在300nm左右。

    2.2  局部基因转染结果  静脉移植1~2周，荧光显微镜下可见有较多转染基因表达，分布于移植静脉中层及内膜，见图2；移植4周，转染基因表达减少。图2  荧光显微镜下观察移植血管转染基因的表达（略）

    2.3  形态学研究结果  各组均可见移植静脉内膜增厚,以14~28d最为明显。术后3d，对照组及空载体组的内膜增生厚度与转基因组差异无统计学意义（P＞0.05）；术后7、14、28d，转基因组内膜增生程度明显低于对照组及空载体组，差异有统计学意义（P＜0.01），见图3；对照组及空载体组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。表1  移植静脉内膜增生程度的比较（略）

    2.4  TUNEL检测凋亡结果  移植血管的凋亡细胞百分比在术后7d开始增高，14d达高峰，28d有所下降；转基因组凋亡细胞增加明显，在术后14d及28d与对照组差异有统计学意义（P＜0.01）；空载体组与对照组差异无统学计学意义（P＜0.05），见表2。表2  移植静脉凋亡细胞百分比比较（略

    2.5  RTPCR结果  转基因组RNA经RTPCR扩增后，可见特异性条带322bp(图4)；而空白对照组及空白纳米粒子对照组未见特异表达条带。这提示纳米粒子可将外源反义mTOR基因导入移植血管并表达。

    2.6  Western blot检测蛋白产物表达  空载体组及对照组在术后3~7d即出现mTOR蛋白产物的表达，14d达到高峰，28d有所下降，两组之间差异无统计学意义（P＞0.05）；转基因组的mTOR蛋白产物表达在术后3d、7d、14d较对组明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05），见图5。

    图5  Western蛋白印迹检测移植血管mTOR蛋白产物表达3  讨  论基因治疗的常用载体主要有腺病毒载体、逆转录病毒载体、脂质体、阳离子聚合物等。病毒载体存在一些问题，如它们的免疫原性、原癌基因特性及一些未知的长期作用，而非病毒的载体则不存在这些问题。纳米粒子是一种新兴的非病毒基因载体，它可以使被包裹的DNA免受水解酶的降解。它在保护基因片段不受破坏的同时可以将目的基因定向运载到血管内的病灶部位，并能透过血管内皮间隙进入血管平滑肌细胞（VSMC），使基因在细胞内或周围组织中长期贮存和释放，起到治疗作用，提高转染基因的稳定性［4］。本实验所用的PLGA纳米粒子具有很好的组织相容性，已经应用于临床，在人体内最终代谢产物为H2O和CO2，无任何毒性。本实验制备的纳米粒子大小在240~350nm之间，包载效率0.3%，DNA通过渗透和扩散的方式释放出来，释放时间为2周左右，属较大颗粒的纳米粒子。mTOR是防治PTCA术后再狭窄药物――雷帕霉素的作用靶蛋白。现已证实，mTOR是一种分子量为289kDa的蛋白激酶，是3磷脂酰肌醇激酶相关激酶家族（PI3Ks）中FK506结合蛋白（FKBP12）的相关蛋白。mTOR信号通路在细胞的生存、生长及增殖过程中起中心调控作用，是细胞周期跨越G1/S期所必需的［1］。临床研究结果表明，应用雷帕霉素药物洗脱支架可以将PTCA术后再狭窄率降低90%以上［5］。深入研究mTOR信号通路可能揭示人类许多疾病的发病机制或病理过程。在前期工作中，我们构建了mTOR的反义基因表达质粒载体，通过转染离体培养的VSMC，初步证实其能够抑制VSMC的增殖，而其在体的作用及机制则有待于深入研究。本实验中，我们采用纳米技术包裹反义mTOR基因进行局部转染，通过动物模型的在体实验研究，进一步观察反义mTOR基因的表达效果，以及其对自体移植静脉内膜增生程度的影响。实验结果，我们成功检测到反义mTOR的mRNA及其蛋白产物的表达，并且发现内膜增生受到显著的抑制。本实验证实，纳米粒子作为基因载体是可行的、有效的，而反义mTOR基因的表达能够有效抑制自体移植静脉内膜的增生。我们推测，其作用机制可能是通过抑制VSMC增殖、促进VSMC的凋亡而实现的。我们的研究也表明，促进VSMC的凋亡可能是防治内膜增生新的有效途径［6］。因此，mTOR可能成为防治内膜增生或移植血管狭窄、闭塞的新的药物或基因干预靶点，对移植血管狭窄、闭塞机制研究有非常重要的作用。

参  考  文  献

    ［1］Fingar DC,Richardson CJ,Tee AR,et al.mTOR controls cell cycle progression through its cell growth effectors S6K1 and 4EBP1/eukaryotic translation initiation factor 4E［J］.Mol Cell Biol,2004,24(1):200216.

    ［2］胡新华，杨军，张志深，等.雷帕霉素靶蛋白反义RNA真核表达载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达［J］.中华实验外科杂志,2006,23（4）:537539.

    ［3］胡新华，张强，孙达欣，等.核转录因子κB及其抑制基因在自体移植静脉中的表达［J］.中华医学杂志，2002，82（1）：15461549.

    ［4］Fishbein I,Chorny M,RabinovichL,et al.Nanoparticulate delivery system of atyrphostin for the treatment of restenosis［J］.J Cotrol Rel，2000,65(2):221229.

    ［5］Moses JW,Leon MB,Popma JJ,et al.Sirolimuseluting stents versus standard stents in patients with stenosis in a native coronary artery［J］.N Engl J Med，2003,349(14):13151323.

    ［6］杨军，胡新华，刘程伟，等.反义寡核苷酸抑制Survivin基因对移植血管内膜增生的影响［J］.中华实验外科杂志,2005,14(12):15161518.

   ［基金项目］国家自然科学基金资助项目（30400435），辽宁省博士启动基金资助项目（20041053）