TFu对肝门部胆管癌细胞系FRH

作者：王志青,吴小鹏

 山东大学齐鲁医院  普外科  （山东  济南  250012）

 基金项目］山东省科技厅科学基金资助项目（2001BDICTA10）  

    【关键词】  胆管肿瘤  N3

    【摘要】目的：探讨N3邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶（N3toluylFlulorouractil TFu）对FRH0201细胞的生物学效应及其作用机制，为胆管癌临床化疗提供参考。方法：光学显微镜、荧光显微镜观察FRH0201细胞在TFu作用后形态学变化；集落形成实验检测TFu对FRH0201细胞的增殖抑制作用；琼脂糖凝胶电泳检测DNA Ladder观察细胞的凋亡；流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡并与5Fu进行比较；MTT试验比较TFu与5Fu等常用化疗药物对FRH0201细胞抑制率。结果：TFu能体外抑制FRH0201细胞的增殖，其作用在0.016~4mmol/L范围内具有浓度依赖性及时间依赖性，同浓度比较抑制率高于5Fu；流式细胞仪检测可见随作用时间延长，TFu及5Fu组G1细胞期增多，S期细胞减少，细胞增殖被阻滞在G1期；细胞凋亡检测可见，随作用时间延长，TFu及5Fu组较对照组细胞凋亡率增加，同时相TFu组凋亡率高于5Fu组；化疗敏感性比较，TFu抑制FRH0201细胞增殖作用不及阿霉素和顺铂，但明显优于5Fu及泰素，联合用药：阿霉素、顺铂和TFu联合对FRH0201细胞抑制率最高，达79.02%，优于阿霉素、顺铂、5Fu联合。结论：TFu可明显抑制胆管癌细胞株FRH0201细胞的增殖，该抑制作用可能通过阻滞细胞周期并进一步诱导细胞凋亡机制发生，同摩尔浓度TFu较5Fu对FRH0201细胞抑制作用强，TFu可作为胆管癌联合化疗的新药。

          The effect of TFu on the apoptosis and proliferation of FRH0201 cholangiocarcinoma cell line

    WANG Zhiqing,WU Xiaopeng

    Department of General Surgery,Qilu Hospital of Shandong University(Jinan 250012,China)

    【ABSTRACT】Objective:To investigate the effect of TFu on FRH0201 cell and to test new drugs for the chemotherapy of cholangiocarcinoma.Methods:Morphological changes were observed by light microscopy and fluorescence microscopy.The effect of TFu on FRH0201 cell was examined by clone formation.Cell cycle and apoptosis were examined by flowcytometric analysis.DNA ladder was used to detect apoptosis.To compare the drug susceptibility of TFu with 5Fu and several other common drugs by MTT colorimetric assay.Results:TFu significantly inhibited the proliferation and clone formation of FRH0201 cell line within concentration of 0.016~4mmol/L.The inhibition ratio was dependent on ascending concentration and time,and that is higher than 5Fu with the same concentration.The morphological character of apoptosis was observed.Flow cytometric analysis indicated that TFu induced a G1 phase arrest and apoptosis more than 5Fu.ADM,DDP and TFu were the sensitive drugs to FRH0201 cel line,and the combination of them can reach the highest inhibition ratio.Conclusion:These results suggests that TFu can more significantly inhibited the proliferation of FRH0201 cell line than 5Fu.The mechanism may be related to the cell cycle arrest in association with apoptosis,which may provide a new approach for treating cholangiocarcinoma.

    【KEY WORDS】Biliary?TFu?Fluorouracil?Apoptosis?Cell cycle    肝门部胆管癌是一种起病隐匿，根治困难，预后很差的消化系统恶性肿瘤，目前认为应采取包括手术、放疗、化疗介入等的综合治疗措施［1］，其中化疗占非常重要的地位。但胆管癌对常规化疗药物敏感性差，化疗效果不理想，而且存在明显的副作用，因此很多学者都在寻找新的化疗药来提高胆管癌疗效。N3邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶（N3otoluylFlulorouracil,TFu)是在5Fu基础上研制的一种5Fu衍生物类抗癌药，初步研究表明，TFu可明显抑制小鼠S180实体瘤及小鼠肝癌实体肿瘤增殖，尚未对胆管癌进行研究，本实验旨在通过观察TFu对FRH0201肝门部胆管癌细胞生物学效应，并与5Fu等多种化疗药物比较，探讨其作用机制，为胆管癌化疗提供参考。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    1.1.1  细胞株  人肝门部胆管癌细胞株FRH0201由山东大学齐鲁医院吴小鹏教授建立［2，3］。

    1.1.2  试剂  TFu由山东大学药学院徐文方教授惠赠。RPMI1640细胞培养基（GIBICO BRL公司产品），胰蛋白酶（Trypsin）(Amresco公司 华美生物制品公司产品)，新生小牛血清（neonatal bovine serum,NBS）(杭州四季青公司产品)。四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DSMO）、吉姆萨色素购自Sigma公司。Annexin VFITC/PI双染凋亡试剂盒（深圳晶美试剂公司）。

    1.2  方法

    1.2.1  细胞培养  FRH0201细胞接种于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，在5%CO2培养箱内37℃、饱合湿度下培养，细胞贴壁生长稳定，2~3d后细胞接近铺满瓶底，进行细胞传代。

    1.2.2  形态学观察  将FRH0201细胞接种于24孔板内，加入含不同浓度TFu的培养液，使其终浓度为8、6、4、2、1、0.25、0.063、0.016mmol/L，并设对照组，每种浓度3个复孔，连续观察。72h后Giemsa染色观察细胞形态。制作细胞飞片，上述浓度TFu作用72h，取出玻片，PBS洗2次，甲醇固定15min，0.01%吖啶橙染色5min，PBS临时封片，荧光显微镜下观察。

    1.2.3  集落形成能力测定  常规收集细胞接种于24孔板中，每孔50个细胞，培养24h后细胞贴壁，弃掉培养液，加入TFu浓度为0.004~8mmol/L的培养液，并设对照组，每种浓度设3个复孔，培养至肉眼可见细胞克隆时行Giemsa染色，镜下计数＞50个细胞的克隆数，计算克隆形成率。

 1.2.4  DNA Ladder测定  常规收集不同用药组与对照组细胞，PBS洗1次，离心收集细胞，加入白细胞裂解液，酚/氯仿液抽提，提取DNA，70%乙醇洗DNA，真空抽干，溶于TE缓冲液中，常规1.5%琼脂糖凝胶电泳，电压80V，电泳40min，观察并摄片。

    1.2.5  流式细胞仪检测细胞周期及凋亡  分别收集＞1×１０６个TFu、5Fu浓度为0.063mmol/L作用24、48h的细胞，对照组为未加药的同期生长细胞，1000r/min离心5min，PBS洗涤1次，再次离心去上清。各取大约1×105个细胞按Annexin VFITC/PI双染凋亡试剂盒说明分别加入Annexin V和PI上机检测；其余细胞用70%预冷乙醇固定，4℃过夜；离心弃乙醇，3ml PBS重悬；400目筛网过滤，离心去上清；1ml碘化丙锭4℃避光染色30min；流式细胞仪检测，激发波长为488nm，发射波长为630nm。

    1.2.6  MTT实验  将FRH0201细胞接种于5块96孔板中，每孔2×103个细胞，培养24h后细胞贴壁，弃掉培养液，实验组加入含0.016~4mmol/L TFu的培养液，对照组加入含有相同摩尔浓度5Fu的培养液，阴性对照组只加培养液，继续培养。加药后24、48、72、96、120h向每孔内加入20μl MTT，继续培养4h后吸出孔内液体，每孔加入150μl DMSO振荡10min，空白孔调零，波长540nm，在DG5031型酶联免疫检测仪上测定各孔吸光值，并计算抑制率。抑制率=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。以时间及浓度为横轴，抑制率为纵轴，绘制抑制率曲线。通过药物抑制浓度计算软件（LOGIT法）1.0计算IC50。

    1.2.7  药物化疗敏感性比较  比较TFu及5Fu、阿霉素（ADM）、顺铂（DDP）、丝裂霉素（MMC）、长春新碱（VCR）、依托泊苷（VP16）、泰素（TAXOL）7种临床常用化疗药物，其实验浓度根据临床常用量采用公式计算出的血浆峰浓度（Peak Plasma Concentration,PPC）［4，5］，联合用药组采用0.5×PPC，TFu、5Fu分别与ADM及ADM、DDP联合。将FRH0201细胞以每孔5×103接种96孔板，细胞贴壁后加入不同的药物及药物联合继续培养，并设对照组，每组设5个复孔，72h后按1.2.6方法检测每孔OD值并计算每组抑制率。

    1.3  统计学方法  流式细胞术结果采用列联表资料的χ2检验，MTT实验结果采用t检验及方差分析。

    2  结  果

    2.1  形态学变化  当TFu浓度高于4mmol/L时细胞培养24h后逐渐变圆，不再贴壁，逐渐死亡，台盼兰染色无活细胞。4~0.016mmol/L组细胞随着药物浓度降低细胞生长密度逐渐升高，细胞逐渐伸展，死亡细胞逐渐减少。

    Giemsa染色：对照组细胞贴壁伸展良好，细胞透光好，核仁清晰；药物作用组细胞皱缩，胞膜出芽形成凋亡小体，核固缩、浓染，核染色质边集，核仁不清。

    吖啶橙荧光染色见药物作用后细胞变小变圆，部分细胞核染色黄绿色，核碎裂、无核仁，碎裂的核由膜包裹着突起于细胞表面呈黄绿色，并见凋亡小体。见图1。 图1  吖啶橙染色示TFu作用后FRH0201细胞形态学变化

    上：对照组（未加药）细胞伸展良好，胞浆均质，核仁清晰

    下：实验组（TFu）组细胞变小变圆，细胞皱缩，细胞核浓染成黄绿色，核仁不清

    2.2  集落形成实验  FRH0201细胞生长旺盛，培养至12d肉眼可见克隆团，对照组克隆形成率为(35.33±4.16)%，0.004mmol/L组克隆形成率为（16.67±2.31）%，0.016mmol/L组克隆形成率为（4.67±4.16）%，大于此浓度组无克隆形成。

    2.3  DNA Ladder测定结果  不同浓度TFu作用后，随浓度升高，出现的DNA Ladder条带越明显，各浓度组均出现典型的凋亡ladder条带。见图2。

    2.4  流式细胞术结果  细胞周期检测可见，随着作用时间延长，用药组相对于对照组G1期细胞增加，S期细胞减少，细胞生长被阻滞在G1期，同时相TFu组G1细胞比例高于5Fu组。细胞凋亡检测可见，随作用时间延长各组细胞早期凋亡率升高，TFu、5Fu组与对照组以及TFu组与5Fu组差异有统计学意义（P＜0.01,P＜0.05）。各时相比较，TFu与5Fu组24h与48h凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05），24h与72h，48h与72h凋亡率差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1，2。 图2  电泳法检测FRH0201细胞DNA Ladder M:Marker;C1~C5:4、1、0.25、0.063、0.016mmol/L TFu作用72h 对照：未加药细胞 表1  各组细胞不同时相细胞周期比例分析 表2  各组细胞不同时相凋亡率比较

    2.5  MTT实验结果  在0.016~4mmol/L范围内，各浓度组TFu及5Fu对FRH0201细胞增殖均有抑制作用，并且具有浓度、剂量依赖性（P均＜0.01），作用时间相同时，随药物浓度升高，抑制率升高，两组在72h比较差异有统计学意义（P＜0.05），TFu组抑制率高于5Fu组；相同浓度下两者比较，随作用时间延长，TFu组与5Fu组抑制率均升高，浓度为4mmol/L时，差异无统计学意义，当浓度分别为1、0.25、0.063、0.016mmol/L时，两者抑制率比较差异有统计学意义（P＜0.05），TFu组抑制作用高于5Fu组。TFu、5Fu的IC50值分别为0.137、0.188mmol/L。见表3。

    2.6  化疗敏感性比较  TFu能有效抑制FRH0201细胞的增殖，抑制率为55.08%，抑制作用优于5Fu（43.86%）及泰素（30.91%），不及阿霉素（79.00%）和顺铂（69.27%）。见图3。联合用药：TFu与阿霉素联合后抑制率由50.29%提高到65.87%，接近阿霉素与顺铂联合（66.52%），高于阿霉素与5Fu联合（58.14%）；阿霉素、顺铂与TFu联合后抑制率可由原来的66.52%提高到79.02%，高于和5Fu联合（68.51%）。见图4。 表3  不同时间不同浓度TFu及5Fu对FRH0201细胞抑制率图4  TFu不同联合方案对FRH0201细胞抑制率比较

    3  讨  论

    TFu是在5Fu基础上研制的新型抗癌药，研究表明TFu能体外、体内抑制小鼠S180实体瘤及小鼠肝癌实体肿瘤增殖。本实验发现TFu在0.016~4mmol/L范围内能有效抑制胆管癌细胞增殖，作用72h后细胞数明显减少并出现细胞凋亡形态学变化，细胞克隆形成明显受到抑制，其抑制作用具有时间、剂量依赖性。当作用时间一定时，随着药物浓度的增加，TFu对胆管癌细胞的生长抑制率逐渐升高，当药物浓度一定时，随作用时间延长，抑制率也明显升高，不同浓度不同作用时间TFu与5Fu组之间的抑制率差异有显著性。随着TFu浓度的提高，其对胆管癌细胞生长的抑制作用和促进凋亡作用变得更为明显，而且发生作用的时间更短。

 本实验通过流式细胞术发现TFu作用24h后即出现G1期细胞比例增加，S期细胞比例减少，细胞生长被阻滞在G1期，随作用时间延长该阻滞作用变明显，且优于5Fu。细胞凋亡检测，作用24h后，TFu、5Fu组与对照组间凋亡率差异尚不明显，48h后开始变明显，至72h凋亡率明显升高。细胞凋亡迟于细胞周期阻滞出现，推测这种细胞周期的阻滞抑制了细胞生长，从而最终引起细胞凋亡。TFu促FRH0201细胞凋亡作用在一定范围内随药物浓度升高而增大，DNA Ladder检测可见，随TFu浓度升高Ladder条带越明显。研究发现，有一种细胞凋亡特异性的发生在细胞周期的不同时相，即细胞先被阻滞在细胞周期某一时相，然后发生细胞凋亡［6］，很多药物通过这种机制诱导细胞凋亡［7］。我们的实验结果，可以从侧面进一步验证了他们的发现，同时这一发现也说明了TFu在作用于胆管癌细胞时的可能的作用机制，其具体的作用机制尚有待于进一步的研究。

    目前临床上针对胆管化疗的药物较敏感的有阿霉素、顺铂、5Fu联合应用，本实验发现阿霉素、顺铂与TFu联合后可提高的联合用药抑制率，优于与5Fu联合，这可为临床制定胆管癌化疗方案提供参考。

    TFu与5Fu相比可更有效抑制FRH0201细胞的增殖并能促进细胞的凋亡，其发挥作用的机制可能是通过阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡途径发生实现的；TFu有望作为临床胆管癌联合化疗的新的参考用药。但该实验只是对胆管癌一种细胞株的体外实验研究，缺乏多种细胞株比较及体内实验证据，其实际临床应用价值有待于进一步研究。

    参  考  文  献

    ［1］Mc Masters KM,Tuttle TM,leach SD,et al.Nonadjuvant chemoradiotion for extrahepatic cholangiocarcinoma［J］.Am J Surg,1997,174:605609.

    ［2］吴小鹏，王占民，何晓冉，等.肝门部胆管癌细胞系（FRH0201）的建立及生物学特性研究［J］.中华医学杂志，2005，85（25）：17841785.

    ［3］李志伟，王占民，吴小鹏，等.利用裸鼠建立人肝门部胆管癌肝门移植模型［J］.中国现代普通外科进展，2004，7（4）：209211.

    ［4］储大同主编.当代肿瘤内科治疗方案评价［M］.北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1999.

    ［5］司徒镇强，吴军政,主编.细胞培养［M］.北京：世界图书出版社，1996，196.

    ［6］Smith GW,Bukowski RM,Hewlett JS,et al.Hepatic artery infusion of 5fluorouracil and mitomycin C in cholangiocacinoma and gallbladder carcinoma［J］.Cancer,1984，54（8）：15131516.

    ［7］刘建伟，唐毅，沈雁，等.细胞分化剂增强三氧化二砷诱导肝癌细胞的凋亡效应［J］.中山医科大学学报，2002，23（6）：423426.