肿瘤微转移的机制与检测

　　作者：刘文峰,徐光,何跃,余巧　　作者单位： 成都，成都军区总医院耳鼻喉科(刘文峰、徐 光、何 跃、余 巧)

　　【关键词】 肿瘤转移机制;检测

　　恶性肿瘤是严重威胁人类生命健康的疾病之一，侵袭与转移是恶性肿瘤最本质的特性之一，也是导致肿瘤患者死亡的主要原因。恶性肿瘤患者死亡率较高，其原因与转移的发生密切相关。统计数据表明，60%的恶性肿瘤患者就诊时实际上已经发生了肿瘤细胞的转移。因此，早期诊断并监控肿瘤的转移对肿瘤的治疗和预后至关重要。本文主要介绍恶性肿瘤发生微转移的机制、如何检测及其对临床的意义。现就近年来对恶性肿瘤转移机制及检测方面的研究进展综述如下。

　　肿瘤的微转移(micromatastasis)是指非血液系统的恶性肿瘤在发展过程中，播散并存活于淋巴系统、血液循环、骨髓、肝、肺等原发灶以外的组织器官中的直径<2mm的微小癌灶[1]。常无明显的临床表现，临床常用的检查方法如超声、CT、MRI、普通的病理检查难以发现[2]。

　　1 恶性肿瘤转移机制

　　1.1 肿瘤转移步骤的模式 肿瘤的侵袭与转移是一个多步骤、多阶段和多基因参与的复杂过程，涉及肿瘤细胞本身特性及其与宿主细胞间的相互作用。癌细胞浸润转移从分子水平上可以分为3个阶段： (1)肿瘤细胞之间的解黏附和肿瘤细胞与标识中文ECM之间的黏附。(2)ECM的降解：肿瘤细胞和宿主细胞分泌的蛋白水解酶，使肿瘤细胞周围的ECM发生降解。 (3)运动：肿瘤细胞被生长因子及趋化因子诱导，向纵深运动[3-4]。转移细胞在循环系统及靶器官将面临几种命运：一是发生凋亡，二是处于休眠状态，三是持续增殖。这主要取决于癌细胞的生物学特性、机体的免疫状态及宿主器官微环境等。

　　1.2 肿瘤浸润转移的分子机制

　　1.2.1 黏附机制转移过程中首先是细胞黏附特性的改变，细胞间黏附分子改变了肿瘤细胞和ECM以及间质细胞之间的结合。涉及到肿瘤细胞转移的黏附分子有：钙黏蛋白家族、整联蛋白家族、免疫球蛋白超家族、选择素家族和透明质酸受体家族。E型钙黏蛋白表达下降或者不表达提示肿瘤有更高的侵袭能力和不良预后，N型钙黏蛋向高表达与许多肿瘤不良预后有关，并且N型钙黏蛋白的高表达常常伴随有E型黏蛋白的低表达[5]。整联蛋白的主要作用是调节细胞与ECM的结合，以及调节作用于细胞肌动蛋白的信号转导通路，从而调节细胞的形态和运动”，整联蛋白还能调整细胞的生殖和凋亡。一些肿瘤中α1β1，α2β1,α3β1，α6β1，αvβ1，αvβ5表达下降，而α2β3,αvβ3表达升高，说明整联蛋白分子在不同的肿瘤浸润阶段有不同的作用机制。

　　目前已发现的免疫球蛋白超家族包括70多种分子。ICAM-1能与白细胞表面的整联蛋白分子αLβ2，αMβ2结合，介导肿瘤细胞和白细胞的结合，使外侵作用增强：DCC则在多数肿瘤中表达缺失，可能影响细胞细胞和细胞-基质之间的相互作用：MCAM与乳腺和黑色素瘤关系密切[6-7]。

　　透明质酸受体是一种多功能的细胞表面跨膜糖蛋白，主要与ECM中的透明质酸结合，也能与胶原蛋白、层黏连蛋白、纤维连接蛋白等蛋白等结合，参与细胞和基质的黏附，CD44是与肿瘤转移有天的该类受体之一，它的分布极为广泛，CD44V6、CD44v9与肿瘤的侵袭和转移密切相关[8]。

　　1.2.2 ECM降解机制 肿瘤转移中一个非常重要的过程是肿瘤细胞对FCM的降解能力。在ECM中BM是阻碍肿瘤转移的主要屏障，IV型胶原是BM的主要万分。降解ECM有关的蛋白酶：(1)丝氨酸蛋白酶，主要包括纤维蛋白溶解酶原激活系统(PA)、白细胞弹力蛋白酶、组蛋白酶G。肿瘤细胞分泌的纤维蛋白溶解酶原激活尿激酶型系统(u-PA)是纤溶酶形成的启动物[9]，纤溶酶可直接降解细胞外基质成分，还可激活金属蛋白酶参与细胞外蛋白水解作用，为肿瘤转移扫清障碍，刺激肿瘤血管生成[10]。(2)基质金属蛋白酶(MMP)与组织金属蛋白酶抑制物(TIMP)，TIMP是MMP的大然抑制物，而在肿瘤的侵袭转移过程中MMP活性增强，则可促进瘤细胞转移，在肿瘤侵袭和转移过程中需要多种基质水解酶协调一致地先后表达，才能使肿瘤细胞成功地完成转移。 (3)类肝素酶，硫酸乙酰肝素聚多糖(HSPG)对维持组织的屏障、维持ECM及许多生物分子稳定性起作用[11-12]。类肝素酶对硫酸乙酰肝素的剪切影响了组织的完整性和功能，导致肿瘤细胞发生迁移[13]。类肝素酶的另一个功能是促进血管生成因子释放进入ECM，加速肿瘤内血管的生成[14]。动物实验表明抑制类肝素酶的活性就能减少发生肿瘤转移的几率[15-16]。

　　1.2.3 肿瘤细胞的迁移和运动机制 参与肿瘤细胞产生迁移远动的分子有： (1)肝细胞生长因子/分散因子(HGF/SF)，HGF/SF与Met受体(c-Met)结合后，刺激卜AK的酪氨酸磷酸化，促进肿瘤生长[17-18]。(2)ECM蛋白，肿瘤细胞周边的ECM蛋白(如：透明连接蛋白、纤维连接蛋白、层黏连蛋白、I型胶原、Ⅳ型胶原和血小板凝血酶敏感蛋白)能引起肿瘤细胞的趋化和趋融[3]，有些通过整联蛋白受体发挥作用[19]。(3)生长因子和细胞因子，这些因子由宿主细胞分泌，可以对一些肿瘤细胞产生促有丝分裂的作用。胰岛素样生长因子(IGF)是肿瘤基质中较强的生长因子[20]，它能以自分泌或者旁分泌的形式促进肿瘤细胞生长。

　　1.2.4 血管、淋巴管生成因子和生长因子 血管新生在肿瘤的生长和转移中起决定作用。目前已知的血管生成调节因子包括：(1)血管生成促进因子有血管内皮生长因子(VEGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，血管生成素，表皮生长因子(EGF)，肿瘤坏死因子(TNTa)，粘附分子。(2)血管生成抑制因子有血管抑素，内皮抑素，转化生长因子(TGF)，血小板因子4，组织金属蛋白酶抑制剂(TIMS)等。血管内皮生长因子(VEGF)/血管通透因子与血管内皮细胞受体结合后促进内皮细胞的增殖、游走、管腔形成以及血管通透性增加。乏氧促进VEGF的显著表达，而癌基因C-Src和p53可正向凋节。有研究表明野生型p53基因，可抑制VEGF的分泌，阻碍大肠癌的血管新生。另外研究表明VEGF通过抑制CD34+细胞的成熟，阻止主要的抗原提呈细胞，树突状细胞的成熟，逃避免疫系统的作用[21]。成纤维细胞生长因子(FGF)可由许多肿瘤和正常组织产生，其中以碱性成纤维细胞生长因子介导血管生成的作用最强，它既是内皮细胞的丝裂原，又是内皮细胞运动的趋化因子。

　　最近研究进展证实：淋巴管生成因子能够诱导肿瘤内和瘤周淋巴管的生成，VEGF-C和VEGF-D的表达与肿瘤淋巴管生成及淋巴结转移密切相关。阻断VEGFR-3信号通路或中和SLC/CCL21等趋化因子活性可抑制淋巴结转移。

　　1.2.5 S100蛋白家族 目前发现的S100蛋白家族有20多个成员，通过与Ca2+结合，它们广泛参与了细胞的生长、运动、细胞周期调节、基因转录以及细胞分化等过程[22-23]。

　　1.2.6 肿瘤转移相关基因 与肿瘤转移有关的基因分为肿瘤转移促进基因及肿瘤转移抑制基因，前者有mtal，H-ras，mts-1，WDNM，PGM21，它们通过参与信号传导，诱导转移表型，调节细胞因子表达来诱导、促进肿瘤转移。目前发现的主要转移抑制基因有以下几种：NM23—组氨酸激酶：KSP磷酸化：抑制ERK1/2激活：MKK4—磷酸化并激活P38和JNK激酶;KAII(CD82)—降低EGFR的敏感性，与整联蛋白反应：BRMSI-空隙连接中的通讯;KISSI-G蛋白耦连的受体的配体;RHOGD12-调节Rho、Rac功能：CRSP3-转录共刺激。

　　1.3 归巢现象 肿瘤向远隔器官的转移是有选择性而非随机的。目前有3种理论来解释这种归巢现象：(1)选择性生长，即肿瘤细胞从血液循环或者淋巴循环向组织内的渗透是广泛存在的，但只在具有适合的生长因子和细胞外基质的环境中生存。 (2)肿瘤细胞只选择性地在归巢器官的内皮表面附着生长。 (3)肿瘤细胞只向产生特异的水溶性的吸附因子的器官趋化。上述机制在实验动物的转移观察中或多或少存在，但目前的实验证据还无法完全解释肿瘤细胞的偏好性转移。

　　2 肿瘤微转移的检测

　　2.1 检测标本 目前研究者根据不同检测方法所选取的标本较多 肿瘤可转移至淋巴结(包括术中所取新鲜淋巴结活组织和石蜡切片)、骨髓、外周血.及其他体液等，较多见的取材为淋巴结、骨髓、外周血，对怀疑腹腔微转移者，可通过腹腔穿刺术或术中进行腹腔冲洗，获取腹腔冲洗液。

　　2.2 肿瘤标志物的选择 肿瘤标记物(tumor marker)是肿瘤细胞产生的特异性物质或在数量上大大高于相应正常细胞的物质。肿瘤标志物包括传统的大分子标志物(主要是大分子蛋白质)和基因标志物。如细胞角蛋白(CKs)、癌胚抗原(CEA)和癌胚抗原信使核糖核酸(CEA m RNA)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶(MMPs)、黏蛋白(MUC1)、 端粒酶基因等。

　　2.3 检测方法

　　2.3.1 细胞学方法 在外周血发现癌细胞是肿瘤微小转移的直接证据。早在1955年Engell报道了140例晚期肿瘤患者外周血中50%以上有癌细胞。但由于血循环中癌细胞数量很少，鉴别良、恶性细胞仍有困难，其特异性和敏感性差，阳性率只有1%，临床上目前己基本不用。

　　2.3.2 病理标本连续切片连续切片的细致分析能从那些经常规组织学检查阴性的淋巴结中提示10%～30%的微转移，但其检出率与切片间距有很大的相关性，一个标本需切出十至上百张片，工作量大，费时费力，有时容易漏检，且对未形成转移病灶的少量癌细胞难以查见，故近年来已很少使用。

　　2.3.3 免疫组化法和放射免疫法 免疫组化法是利用抗原抗体反应的原理来对组织切片、细胞、涂片进行染色定位，以寻找组织(如淋巴结、标本切缘组织)、血液、骨髓中的肿瘤细胞，其诊断准确度及辨别率均优于常规组织切片染色[21]。其缺点为可出现交叉反应，不均质性分布表达，阳性染色结果判断标准不确定，切片数量有限，易遗漏，且费用较高。因此，尚未能成为临床检测的常规手段。放射免疫法是选择特异针对肿瘤细胞表面抗原的抗体，标记放射性同位素，输入患者体内，根据显像结构可以准确地判断转移病灶的位置。该法不仅具有较高的灵敏度，而且有较高的特异性，但不一定适于所有肿瘤的检测。

　　2.3.4 流式细胞术 基本原理是用荧光标记的单抗与肿瘤细胞结合后，通过流式细胞仪即可检测到肿瘤细胞，其最大优点是可以计数肿瘤细胞数，并且这一过程是完全自动化[5]，客观准确。但因其方法复杂、价格昂贵，同时还有标本固定，贮存及研究人员间的差异等因素的干扰，临床难以推广实施[26]。

　　2.3.5 转基因法 将Lacz基因转入肿瘤细胞内，与肿瘤细胞基因组整合，再将肿瘤细胞接种于动物体内，用染色体基因的底物X2gal对细胞或组织进行染色，追踪肿瘤发展和转移的进程，是观察肿瘤微转移动物模型最特异的手段。 也有用绿色荧光蛋白(GFP) 基因转入肿瘤细胞内检测微转移灶的，可直接在显微镜下观察肿瘤细胞和微转移灶的形成，免去染色的麻烦，但这一方法技术条件要求高，不适于临床研究[27]。

　　2.3.6 PCR技术 利用PCR技术检测肿瘤基因标志物是目前认为最适于发现肿瘤早期转移的方法。PCR技术又称体外基因扩增法，能在实验室的试管内将所要研究的一个目的基因或某一DNA片段，在数小时内扩增106～108倍。其优点：灵敏度高、结果判断直观、准确、能反映标本的整体情况、易标准化，检查耗时短。其局限性：因缺乏肿瘤特异性靶RNA、靶RNA的非特异性表达、方法学本身的限制以及RNA易被广泛存在的RNA酶降解等冈素的影响而出现假阳性和假阴性。

　　2.3.7 基因芯片技术 基因芯片也称cDNA芯片，是生物芯片最主要的一类，表现为cDNA或寡核苷酸片段的微小点阵形式，也称为微阵列(microarray)，检测时，待测RNA或DNA以荧光或同位素标记后，与排列成阵列基因片段杂交，通过激光扫描读出点阵的杂交信息，用电子计算机及相应软件包量分析。其优点：具备高通量、高效率、高自动化特点，适于肿瘤基因的表达研究。局限性：可能出现交叉杂交，分析结果有假阳性、假阴性可能，对样本RNA的纯度和量的要求很高，检测结果易受载体材料、操作和制作方法的影响而欠稳定，必须进行繁琐的标准化、分析结果往往要结合Northern印迹或PCR来验证等。

　　3 结 论

　　大量的临床研究已经证实，存在微转移的肿瘤患者整体的生存率下降、预后不良，微转移还可以作为监测治疗疗效和早期复发转移的指标。随着检测方法的不断改进与革新，微转移检测准确率的不断提高，将为临床干预对策、肿瘤的治疗甚至消灭提供新的思路与启发，有助于确定建立在治疗强度、持续时间上不同的、个体化的治疗方案，对降低肿瘤患者的死亡率有着积极的意义。

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