褪黑素对Alzheimer病模型大鼠认知功能和海马tau蛋白过度磷酸化的影响

褪黑素对Alzheimer病模型大鼠认知功能和海马tau蛋白过度磷酸化的影响作者：王敏，张峰，李晓红，张媛媛，赵东，王栋    作者单位：250012济南，山东大学医学院（王敏，李晓红，张媛媛，王栋）；济南市中心医院神经内科（张峰）,病理科（赵东）    【摘要】  目的 研究褪黑素（MT）对Alzheimer病（AD）模型大鼠认知功能和海马tau蛋白过度磷酸化的影响。方法 给大鼠海马内注射凝聚态β淀粉样蛋白（Aβ）2535制作AD模型；MT组大鼠从制模前7 d至制模后19 d每日腹腔注射MT，AD组大鼠制模后腹腔注射生理盐水；用Morris水迷宫试验检测大鼠的认知功能，银染法观察海马神经元形态，免疫组化法观察过度磷酸化tau蛋白的表达，并与正常对照组比较。结果 MT组大鼠Morris水迷宫试验结果明显好于AD组（均P<0.001）;海马CA1区磷酸化tau蛋白阳性细胞数（60.0±2.3）明显少于AD组（98.4±3.0）（P<0.001），与正常对照组比较差异无统计学意义;海马CA1区神经元纤维形态较AD组规则。结论 MT可明显改善AD大鼠的认知功能，并且抑制海马tau蛋白的过度磷酸化。    【关键词】  褪黑素；Alzheimer病；认知功能；tau蛋白；磷酸化    Effects of Melatonin on cognition and tau hyperphosphorylation in hippocampus of Alzheimers disease model rats  WANG Min,ZHANG Feng,LI Xiaohong，et al.Medical College of Shandong University, Jinan 250012, China    Abstract：Objective  To sdudy the effects of Melatonin（MT） on cognition and tau hyperphosphorylation in hippocampus  of Alzheimers disease (AD) model rats.Methods  Aβ2535 was injected into the hippocampus to make AD model rat.MT was injected intraperitoneully into rats of MT group 7 days before and 19 days after modeling.Normal saline (NS) was injected intraperitoneully into rats of AD group after modeling.The cognition was tested by Morris water maze.The pathological changes of hippocampus was observed by Bielschowsky staining and the tau hyperphosphorylation was detected by immunohistochemistry staining.The results were compared with normal control group.Results   In MT group, the results of Morris water maze were significant better than those in AD group (all P<0.001); and the amount of Ptau positive cells (60.0±2.3) was remarkable decrease than that in AD group (98.4±3.0) (P<0.001); but there was no difference between MT group and normal control group.The neurofibrils in hippocampus of MT group were more regular than that in AD group.Conclusions  MT improves cognition of ADrats and inhibits hyperphosphorylation of tau in hippocampus.     Key words：Melatonin;Alzheimers disease;cognition;tau;phosphorylation     Alzheimer病（AD）是老年期痴呆中最常见的类型。过度磷酸化的tau蛋白是神经原纤维缠结（NFTs）的主要组成成分, 与AD的发病有着不可分割的联系。褪黑素（MT）具有抗衰老、增强免疫、抗氧化应激等多种作用。近年来的研究［13］表明，MT可以改善β淀粉样蛋白（Aβ）所致AD大鼠海马的胆碱能系统的功能，抑制氧自由基的损害作用，且对异丙肾上腺素（IP）诱导的AD大鼠海马tau蛋白异常磷酸化有明显的抑制作用。然而，MT对Aβ所致AD大鼠海马tau蛋白磷酸化的抑制作用尚未见报道。本实验采用单侧海马注射Aβ2535制作AD大鼠模型，并予以MT处理，从行为学、形态学及抑制磷酸化tau蛋白形成等方面观察MT对AD大鼠神经细胞的保护作用。1  材料与方法    1.1  材料    1.1.1  动物及分组  健康雄性Wistar大鼠24只，由山东大学实验动物中心提供，质量250～300 g，饲养室温为20℃，光照与黑暗时间为12 h∶12 h。将Wistar大鼠随机分为AD组、MT组和正常对照组，每组8只。    1.1.2  药品、试剂与仪器  MT和Aβ2535系美国Sigma公司产；用无菌生理盐水（NS）将Aβ2535溶解稀释成5 μg/μl，37℃孵育72 h，使其变为聚集态的Aβ2535，放置于4℃冰箱备用；兔抗Pser202 Tau系武汉博士德生物工程有限公司产；SP超敏试剂盒系福州迈新生物技术开发有限公司产；脑立体定向仪江湾Ⅰ型C系上海川沙花木农机厂制造；Morris水迷宫系中国医学科学院药物研究所研制。    1.2  方法    1.2.1  动物模型制作及处理  大鼠常规饲养2周后，用4%水合氯醛（1 ml/100 g）腹腔注射麻醉，固定于脑立体定位仪，颅顶剪毛，做正中切口暴露前囟，参照大鼠脑立体定位图谱［4］，以前囟为原点，向后3.5 mm，旁开2.0 mm为穿刺点，钻开颅骨，自脑表面进针3.0 mm至海马，用微量进样器将Aβ2535 2 μl（10 μg）、正常对照组为NS 2 μl缓慢注入（10 min），留针10 min。退针后，局部消毒，涂抹少量新诺明粉末，缝合皮肤。术后给予青霉素8万U肌肉注射及切口处碘伏消毒，每天1次，共3 d。MT组大鼠自手术前7 d起，腹腔内注射MT 5 mg/（kg·d)，连续26 d；术后AD组和正常对照组大鼠腹腔注射NS 1 ml/(kg·d)，连续19 d。    1.2.2  空间学习记忆力检测  采用Morris水迷宫法［5］。Morris水迷宫参照中国医学科学院药物研究所设计，水温保持在19～20℃，周围参照物不变。于手术后14 d进行水迷宫训练，每天上午、下午各训练1次，连续5 d。训练时按东北、西北、东南、西南4个象限依次将大鼠面向池壁放入水中，设定最长游动时间为120 s，以秒表记时，记录大鼠找到平台所需时间，记做潜伏期。然后撤除平台，选定和平台相对的象限中点为入水点，记录120 s内大鼠为搜索平台而穿过平台区域的时间比例，以及穿过平台区的次数（以术后第19 d的成绩作为测试结果）。数据采集和处理由Morris水迷宫图像自动监视处理系统完成。    1.2.3  脑组织病理学观察  在Morris水迷宫测试结束后，大鼠腹腔注射4%水合氯醛（1 ml/100 g）麻醉后，打开胸腔，暴露心脏，将自制灌注器经左心室插入升主动脉升段，剪开右心耳，快速灌注4℃生理盐水，待右心耳出流出澄清液体，换4%多聚甲醛400 ml灌注，先快后慢，直至大鼠四肢强直，快速取脑。将脑组织置于4%多聚甲醛中固定24 h。于注射点前后各2 mm处取材，乙醇系列脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋、切片，片厚4 μm。改良Bielschowsky染色：组织切片脱蜡至水，于37℃温箱内用20%的硝酸银水溶液避光浸染25～35 min，蒸馏水洗3～5 min；用10%甲醛溶液还原数秒至切片呈黄色为止，水洗3～5 min；用氨银溶液滴染20～40 s，倾去染液，直接用10%甲醛溶液再次还原1～2 min，更换2次溶液至切片呈棕黄色，水洗3～5 min；5%硫代硫酸钠水溶液固定3～5 min，水洗3～5 min；用滤纸将切片周围水分吸干；常规脱水、透明，中性树胶封固。光学显微镜观察海马神经元胞体和轴突的形态。    1.2.4  磷酸化tau蛋白表达检测  切片常规脱蜡至水，按SP超敏试剂盒说明书操作（一抗为tauPser202），DAB显色，苏木素复染，常规脱水、透明，中性树胶封固。光镜下观察细胞浆着棕褐色为磷酸化tau蛋白染色阳性。每只大鼠取10张切片，每张切片高倍（×400）镜下计数海马CA1区5个视野阳性细胞总数，计算每个视野平均阳性细胞数。    1.2.5  统计学方法  数据以均数±标准差(±s)表示；采用SPSS 11.5统计软件行单因素方差分析。2  结  果    2.1  各组大鼠Morris水迷宫测试结果比较  见表1。与正常对照组比较，AD组的逃避潜伏期显著延长，撤除平台后AD大鼠在原平台象限内游泳时间占总游泳时间百分比降低，穿过原平台位置的次数明显减少（均P<0.001）。MT组与AD组相比较，逃避潜伏期明显缩短，撤除平台后大鼠在原平台象限内游泳时间占总游泳时间百分比升高，穿过平台位置的次数明显增多（均P<0.001）；MT组与正常对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。表1  各组水迷宫测试结果比较(±s，n=8）组别逃避潜伏期    2.2  各组大鼠海马组织学表现  见图1。正常对照组大鼠海马结构和神经元形态正常，胞体未着色，轴突呈棕褐色，神经元纤维排列有序，稀疏。AD组神经元纤维形态不规则，有密集、融合、断裂现象，银染加深，但未见明显的NFTs。MT组神经元纤维排列较AD组明显整齐、有序，密集程度较低，但比正常对照组差。    2.3  各组海马CA1区磷酸化tau蛋白的阳性细胞数比较  见表2、图2。与正常对照组比较，AD组大鼠表2  各组大鼠大鼠海马CA1区磷酸化tau阳性注：与正常对照组比较△P<0.001；与AD组比较*P<0.001    海马CA1区神经细胞胞浆呈深棕色，磷酸化tau蛋白阳性细胞明显增多（P<0.001）； MT组大鼠海马CA1区神经细胞胞浆呈浅棕黄色，阳性细胞数比AD组明显减少（P<0.001）。正常对照组与MT组大鼠海马CA1区磷酸化tau蛋白阳性细胞数差异无统计学意义。    图1  A：AD组海马神经元纤维不规则，有密集、融合、断裂现象；B：MT组神经元纤维排列整齐有序，不密集（改良Bielschowsky染色，×200）图2  A：AD组海马CA1区有较多磷酸化tau蛋白阳性细胞；B：MT组磷酸化tau蛋白阳性细胞明显少于AD组（免疫组化染色，×200）3  讨  论    AD是一种以获得性持续性记忆减退、认知功能障碍以及行为异常为特征的中枢神经系统退行性疾病。大量的实验验证，Morris水迷宫作为检测实验动物学习记忆水平的重要工具，可以较好的评价认知功能。本实验Morris水迷宫测试结果发现，AD组较正常对照组逃避潜伏期明显延长，撤离平台后在原平台象限内游泳的时间占整个游泳时间的百分比显著降低，表明AD组大鼠学习记忆能力明显下降。MT组大鼠测试结果明显好于AD组，而与正常对照组比较差异无统计学意义。表明MT可以显著改善AD大鼠的认知功能，对AD大鼠空间记忆损伤具有保护作用。有研究［6］指出AD患者脑内tau蛋白过度磷酸化水平与患者临床痴呆程度成正相关，故抑制tau蛋白过度磷酸化可能是MT改善AD大鼠认知功能障碍的机制之一。　　过度磷酸化的tau蛋白（一种微管相关蛋白）是AD病理改变中重要的标记性蛋白，AD患者病程早期即有脑脊液（CSF）tau蛋白水平升高，且持续于整个病程的各个阶段［7］。彭小松等［8］研究发现凝聚态的Aβ2535能使神经元发生退行性改变，并导致tau蛋白在特定的位点磷酸化增多。本实验结果显示大鼠海马内注射Aβ2535后，海马CA1区神经元tau蛋白在特异性位点ser202的磷酸化水平增加，且神经元纤维走形紊乱、增粗，说明Aβ2535可诱导tau蛋白过度磷酸化水平升高，从而破坏神经元微管系统，对海马神经元产生明显的神经毒性作用，导致AD样病理变化的发生。　　MT是哺乳动物和人类松果腺主要在夜间分泌的一种吲哚类神经内分泌激素,具有调节昼夜节律、睡眠、内分泌、免疫及抗衰老、抗氧化、抗应激等多种重要生理功能。大量实验及临床证据都显示AD患者存在MT合成和分泌下降、节律紊乱等多方面的异常，提示MT缺失可能与AD发病有关。近年来的研究［9］发现MT可通过多种途径抑制Aβ介导的神经毒性作用，如破坏Aβ的β折叠，抑制Aβ的积聚；清除氧自由基，降低脂质过氧化物（LPO）水平；调整Bax/Bal2的比值，减少神经元和胶质细胞的凋亡等。本研究观察到，给予MT治疗后，AD大鼠海马CA1区磷酸化tau蛋白表达水平显著降低，神经元损伤明显减轻，神经元突起保留完整，神经元纤维排列规则，无明显增粗、肿胀、断裂，说明MT可能通过抑制tau蛋白的过度磷酸化，减轻海马神经元损伤，从而拮抗Aβ的神经毒性作用，减轻AD的病理改变，达到治疗AD的目的。【参考文献】［1］沈玉先, 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