p38在慢性鼻-鼻窦炎和鼻息肉中的表达及意义

　　作者：亢丽芳　　作者单位：1.山西医科大学; 2. 山西医科大学第一医院耳鼻咽喉-头颈外科，太原 030001

　　【摘要】目的 探讨p38在慢性鼻-鼻窦炎、鼻息肉以及正常下鼻甲黏膜组织中的表达及对免疫学细胞因子的影响。方法 分别采用Western blot法、ELASE法检测p38、IL4和IFNγ在20例慢性鼻-鼻窦炎组织(实验组1)、20例鼻息肉组织(实验组2)和15例正常下鼻甲黏膜中的表达(对照组)，比较它们在不同组织中表达的差异;分析p38与IL4、IFNγ的相关性。结果 ①p38在两实验组间的表达差异无统计学意义(P>0.05),但均高于对照组(P<0.05);②IL4只在鼻息肉组表达高于对照组(P<0.05);③IFNγ在实验组的表达均高于对照组(P<0.05)，且以慢性鼻窦炎组更显著(P<0.05);④在慢性鼻-鼻窦炎组，p38与IFNγ呈正相关，而在鼻息肉组p38与IL4呈正相关。结论 ①IL4、IFNγ在慢性鼻-鼻窦炎组与鼻息肉组表达优势不同;②p38 MAPK高表达可能会促进T细胞向Th1、Th2两方面分化;③慢性鼻-鼻窦炎、鼻息肉的炎症反应过程不尽相同。

　　【关键词】 慢性鼻-鼻窦炎;鼻息肉;p38 MAPK; IL4; IFNγ

　　KANG Lifang1, XIA Lijun2

　　(1. Shanxi Medical University; 2. Department of Otolaryngology & Head and Neck Surgery，

　　First Hospital of Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， China)

　　To investigate the different expressions of p38 protein in chronic rhinosinusitis(CRS)，nasal polyps (NP) and normal mucosa tissues, and to explore its effect on immunology cytokine. Method Tissue samples were obtained from 20 patients with chronic rhinosinusitis， 20 patients with nasal polyps and 15 patients with normal mucosa tissues. Expression of p38 MAPK was determined by the Western blot method; IL4 and IFNγ were determined by the ELASE method. Result ① Compared with controls， expression of p38 protein was significantly increased(P<0.05),　but was not significant between the two experimental groups (P>0.05). ②　IL4 was significantly increased only in NP tissues (P<0.05). ③　Compared with controls, IFNγ was increased both in CRS and NP tissues (P<0.05), more significantly in the former. ④　There was a positive correlation between p38 protein and IL4 in NP and a positive correlation between p38 protein and IFNγ in CRS tissues.Conclusion ① Expressions of IL4 and IFNγ are different in CRS and NP. ② p38 protein may induce T cell to differentiate into Th1 or Th2 cells. ③ The inflammatory reaction of CRS and NP are not exactly the same.

　　Key words: Chronic rhinosinustis; Nasal polyps; p38 MAPK; IL4; IFNγ 慢性鼻-鼻窦炎(chronic rhinosinustis, CRS)和鼻息肉(nasal polyps,NP)均为最常见的上呼吸道慢性炎症性疾病，二者的发生常互相关联，但它们究竟是同一个疾病的不同发展阶段，还是两种完全不同的疾病，目前尚存在较大争议[1]。最近的大量研究表明，CRS和NP在临床表现、组织形态学特征、病因学、临床治疗及预后等方面存在明显的差异，不少学者因此提出了CRS和NP是两个不同疾病实体的观点[2]。本文试图围绕这一热点问题，从炎症本质入手，以在炎症反应中起关键作用的Th细胞因子为切入点，探讨CRS和NP炎症反应的异同。

　　1 资料与方法

　　1.1 标本来源及制备 收集2007年10月～2008年4月在我院住院部和门诊行鼻内镜手术的患者标本，患者均无变应性鼻炎、支气管哮喘、阿司匹林耐受不良和其他系统严重疾患。研究前1个月内未行激素和抗组胺药物治疗。鼻-鼻窦炎组：20例，男13例，女7例;15～65岁，平均38岁。典型鼻窦炎症状持续12周以上，单侧或双侧鼻部CT检查阳性，在内镜检查和手术中未发现息肉形成。鼻息肉组：20例，男11例，女9例;13～68岁，平均37岁。单侧或双侧鼻部CT检查阳性，息肉标本经病理证实且术中排除真菌感染。下鼻甲黏膜组：15例，男9例，女6例; 16～54岁，平均37岁。均为我院接受鼻内镜手术的鼻中隔偏曲患者，术中取代偿肥大之下鼻甲黏膜作为对照组。

　　术中采集标本后放入-80℃冰箱保存备用。

　　1.2 蛋白含量的检测

　　1.2.1 Western blot方法检测磷酸化p38(pp38)含量 分别切取50～100mg　CRS、NP组及对照组的黏膜组织，尽量剪碎，按照北京普利莱公司胞浆胞核蛋白提取试剂盒的说明提取核蛋白。经蛋白定量，每条泳道加样15μL行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)分离蛋白质,经电转印将蛋白质转移到硝酸纤维素滤膜上。牛血清蛋白室温封闭1h。加入稀释度为1∶200的兔抗pp38多克隆抗体(美国SantaCruz公司),4℃孵育20h。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG,稀释度为1∶2000,室温下孵育2h，经TBS洗涤,DAB显色,分析各条带磷酸p38(pp38MAPK)和βactin的灰度值，并相除来进行标准化，作为p38的相对活化水平。

　　1.2.2 ELASE法检测组织中IL4、IFNγ的蛋白质含量 分别切取50～100mg各组黏膜组织, 尽量剪碎，加入0.5～1mL的组织蛋白萃取试剂(PMSF)。匀浆机中进行匀浆，置于冰块上，几分钟后再进行一次匀浆，重复几次直到组织很碎。离心，取上清液在-20℃冰箱保存备用。试剂盒均购自美国RB公司。操作步骤按试剂盒说明书进行。

　　1.3 统计学处理 所得数据输入SPSS13.0 for Windows软件包进行统计学处理。计量资料3组均数间比较用方差分析。用Pearson相关分析CRS、NP中p38 MAPK与IL4、IFN-γ之间的相关性。

　　2 结 果

　　pp38及βactin凝胶电泳结果。pp38在CRS、NP及对照组灰度的相对值分别为：0.783±0.074、0.829±0.082、0.383±0.053。方差分析结果，F=188.587，P<0.001; CRS与NP组相比，差异无统计学意义(P=0.053);与对照组相比，二者均显著增加(P<0.05)。

　　 pp38及βactin凝胶电泳图 各组IL4、IFNγ的表达。IL4在NP组表达明显高于对照组(P<0.001)，在CRS组织中表达差异无统计学意义(P=0.308);IFNγ在NP及CRS组表达均高于对照组(P<0.05)，且在CRS组表达高于NP组(P<0.05);相关分析显示，在CRS中pp38与IFNγ呈正相关(r=0.68，P<0.01)，与IL4的相关性无统计学意义(r=0.207，P=0.30);而在NP组织中pp38与IL4呈正相关(r=0.72，P<0.01)，与IFNγ的相关性无统计学意义(r=0.203，P=0.39)。 各组IL4、IFNγ表达的比较

　　3 讨 论

　　p38蛋白是新近发现的与炎症、应激反应密切相关的蛋白激酶(MAPK), 激活后的p38即由胞浆进入到细胞核，表现为其活性形式磷酸化p38(pp38)，它是细胞内主要的信号转导系统。近年的研究发现，在哮喘、慢性阻塞性肺病及变应性鼻炎中，p38活化与各种细胞因子炎症介质的释放有关[34]，而CRS、NP的病理学改变与哮喘、变应性鼻炎同属于呼吸道黏膜炎症反应且二者密切相关[5]。此外有报道认为， p38 MAPK能够促进T细胞增殖[6],且p38在诱导Th1/Th2分化中的作用是双方面的[7]。那么，p38在CRS、NP中是否表达、表达水平是否相同，它在CRS、NP中诱导Th细胞分化的方向是否相同?由于细胞因子主要分为Th1和Th2两型,且分别以γ干扰素(interferonγ, IFNγ) 、白细胞介素4 (interleukin4, IL4)为代表[8]。因此本实验通过检测p38在CRS、NP中的表达情况及其对IL4、IFNγ在CRS、NP表达中各自的诱导作用来探讨上述问题。

　　CRS、NP的本质是一种非特异性的鼻黏膜的慢性炎症反应，而Th类细胞因子是炎症反应过程中最主要的细胞因子，因此无论是CRS还是NP，Th细胞及其产生的细胞因子在其炎症的发生发展过程中都应当起到了关键性的作用。但是，是否Th细胞因子在二者中起到了均等的作用?结果表明，在NP组织中Th2细胞因子IL4 、Th1细胞因子IFNγ的表达水平均高于正常下鼻甲黏膜组织;而在CRS中仅显示出高于对照组的IFNγ水平，IL4水平与对照组比较差异无统计学意义。因此可以这样认为， 与CRS相比较，NP显示了更强的Th2细胞因子浸润优势。

　　pp38与Th细胞因子的相关性同时显示，在CRS中pp38与IFNγ呈正相关，在NP中pp38与IL4呈正相关，这与CRS、NP中Th细胞因子的不同浸润优势相一致。由此我们推测，在CRS及NP中，p38可能均被促炎因子磷酸化激活，但在进一步的验证机制中它可能诱导了不同的Th细胞及其细胞因子的表达趋势，使得CRS及NP呈现出不同的Th细胞及其细胞因子的浸润状态。那么从Th细胞因子表达优势不尽相同的角度看，我们认为慢性鼻鼻窦炎和鼻息肉的炎症反应过程仍然有其各自的特点，其中信号转导通路可能发挥着重要的作用，因此认为二者是同一种疾病的说法有待于进一步研究。

　　【参考文献】

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　　[2] 陆翔，刘争，崔永华. 慢性鼻-鼻窦炎和鼻息肉的同异：2个不同的疾病实体[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志，2007，21(8)：382384.

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　　[6] Yu T C， Liu Y， Tan Y， et al. Shock waves increase Tcellproliferation or IL 2 expression by activating p38 MAP kinase[J]. Acta Biochim Biophys Sin， 2004， 36(11)：741748.

　　[7] 于哲,刑飞跃,曾耀英. MAPK信号通路在诱导Th1/Th2分化中的作用[J].现代免疫学,2007, 27(1):8184.

　　[8] Berger A. Th1 and Th2 responses: What are they[J]. BMJ, 2000, 321(7258):424425.