内耳水通道蛋白的表达与调控

　　作者：邓安春　黄德亮      作者单位：解放军总医院耳鼻咽喉-头颈外科(北京　100853)

　　【关键词】 内耳 水通道蛋白

　　水是生命体最基本的组成成分，机体的水平衡对哺乳动物的生命维持非常重要。20世纪90年代以前，一直认为水的转运机制就是简单扩散;但水能迅速通过细胞膜的脂质双分子层，而且不同组织来源的细胞膜对水分子有着不同的通透性，用简单扩散机制不能对此做出圆满的解释，因此推测细胞膜上可能存在协助水分子通过的膜蛋白。1988年Agre从红细胞膜上分离出一种可使水通透性明显增加的蛋白， 1991年对该蛋白的cDNA分子及功能进行了鉴定，在分子水平证明存在通道介导的水的跨膜转运，于1993年将该蛋白正式命名为水通道蛋白-1(aquaporin 1, AQP-1)[1]。此后不断有AQP分子被发现，组成了壮观的AQPs家族。AQPs概念的确立使得人们对液体跨膜和跨细胞转运机制进行重新认识，帮助人们从分子水平认识与水通道功能障碍有关疾病的发病机制。

　　AQPs已成为研究的热点，尤其在Agre因发现AQP而获得2003年诺贝尔奖以后，对AQPs的研究更加深入而广泛。迄今，已从哺乳动物组织中鉴定出13种水通道蛋白亚型(AQP0-AQP12),它们广泛分布于机体不同组织器官中，介导着不同类型的跨生物膜水转运[2-4]。在不同组织、不同细胞中有不同AQPs亚型的分布，执行不同的功能。在内耳，由于有关结构取材十分困难，研究相对滞后。在哺乳动物内耳现已发现7种AQPs亚型，包括AQP1、2、3、4、5、7和9[5-16]，它们都或多或少地参与内耳液体的调节。进一步探索AQPs及其亚型在内耳的作用机制、功能调控及潜在的生理学和病理学意义，不但有助于研究以水代谢障碍为特征的一些内耳疾病如梅尼埃病等的发病机理的分子机制，而且也可能为治疗这类疾病提供新的思路。现就相关方面的研究进展综述如下。

　　1　水通道蛋白的结构与分类

　　AQP由一系列与水通透性有关的具有同源性的细胞膜转运蛋白组成，分子量约为28 kD，属于庞大的主体内在蛋白(major intrinsic protein, MIP)家族成员。大多数AQPs亚型的cDNA已被克隆，它们具有高度同源性。其基因组成具有一定的共性，AQP0、AQP1、AQP2、AQP4、AQP5和AQP6的基因由四个外显子和三个内含子组成， AQP3、AQP7、AQP9和AQP10是由六个外显子和五个内含子组成，较大的第一外显子编码氨基端而其余较小外显子编码羧基端。

　　AQPs属糖蛋白，其结构具有高度保守性，含有天冬酰氨-脯氨酸-丙氨酸(Asn-Pro-Ala，NPA)重复序列。NPA是MIP的特征性序列，也是AQPs家族成员共有的特征性结构，在此元基附近的氨基酸序列在所有水通道蛋白中均高度保守。AQPs的一级结构为跨越细胞膜6次的单肽链，其氨基和羧基末端均位于细胞内。每个AQPs的氨基端结构极其相似，而羧基端结构各有特点，提示氨基端结构决定了AQPs功能的共性，羧基端结构构成了各成员功能的特异性。6个跨膜区域由5个环相连，2个胞内环(B、D)和3个胞外环(A、C、E)。每个跨膜区域均呈α螺旋结构，6个跨膜区域包绕着B环及E环形成具有独立水通道活性的筒状结构，即为一个单水孔。其高级结构由同源四聚体组成，每个四聚体都含有四个围绕中心孔隙排列而向外伸出的结构域，每个结构域即一个AQPs单体[17]。Walz[18]等认为该四聚体在膜上的组装是维持AQPs稳定性及正常功能所必需的。

　　根据基因序列同源性、种系发育比较及通透特性，可将AQPs分为两大类：即传统意义上的AQP及甘油AQP， 前者属于高度水选择性通道，即除水之外，不转运其它小分子溶质，包括AQP0、AQP1、AQP2、AQP4、AQP5、AQP6及AQP8;后者为相对水选择性通道，即对水、甘油和其它小分子溶质均有通透性，包括AQP3、 AQP7、AQP9及AQP10。不过，AQP6还可通过阴离子，AQP1还对CO2有通透性，但对CO2的通透性与水相比较低。另一种分类方法就是根据AQPs功能能否被汞抑制而分为汞敏感性蛋白和不敏感性蛋白。大部分AQPs功能可被汞制剂(HgCl2)所抑制，只有AQP4和AQP7对汞不敏感，其功能不被汞制剂抑制。一般认为，定位于E环NPA序列前的半胱氨酸(C-189)是特定的汞敏感结合位点，其与汞化合物结合后通道即被抑制[2，6]。

　　2　水通道蛋白在哺乳动物内耳的表达情况

　　很多研究者应用原位杂交、RT-PCR和免疫组化等方法对AQPs各个亚型在内耳的分布情况进行了研究。研究对象主要是大鼠、小鼠和豚鼠，对人内耳AQPs分布情况的研究较少，Couloigner等[19]报道， AQP2在人耳内淋巴囊上皮细胞可见有表达，主要表达在细胞质里。林琳[5]根据相关资料将AQPs不同亚型在哺乳动物内耳的表达情况总结成表，有助于理解。不过，目前哺乳动物内耳AQPs各亚型的分布情况尚无统一的认识。Takumi等[6]发现AQP4在大鼠耳蜗的Hensen 细胞、内沟细胞和前庭终器的支持细胞中有阳性表达。Sawada 等[7]发现AQP1在大鼠内耳血管纹和内淋巴囊有阳性表达，血管纹的表达局限在中间细胞。Beitz等[8]对AQPs在大鼠内耳的表达进行了较为系统的研究，发现AQP1在内耳所有组织中都非常丰富，AQP2、3、4只在内淋巴囊检测到，AQP5在Corti器和前庭膜表达，而AQP0、7、8在内耳没有表达。其后，Merves等[9]对胚胎发育期的小鼠内耳AQP2的表达情况进行了研究，发现在耳囊发育早期(5～10天)其弥漫性分布于耳囊腔上皮，然后随着发育的成熟逐渐局限于内耳。在胚胎12至13天，AQP2在前庭、壶腹和发育中的蜗管等处呈均质性的表达;15至18天时，AQP2表达局限于前庭和蜗管区;胚胎晚期(18天)，AQP2在内淋巴囊、内淋巴管、血管纹和内耳感觉区传入神经纤维均有较强的表达。Mhatre等[10]对AQP2在大鼠和小鼠内耳的表达情况进行了对比，发现在内淋巴周边的结构中均有阳性表达，包括前庭膜、Corti器、内外沟细胞、螺旋韧带等，大鼠与小鼠间似乎没有差别。但Miyabe等[11]对豚鼠、小鼠和蒙古沙鼠耳蜗的AQP1和AQP4的分布情况观察后发现，AQP1强烈表达在豚鼠的耳蜗螺旋韧带的III 型纤维细胞和基底膜下的间充质细胞以及一些螺旋韧带的IV型纤维细胞、螺旋缘的纤维细胞和靠骨性听泡的淋巴管周围间隙排列的间充质细胞等处，在小鼠只表达在前庭膜内侧部，而在耳蜗基底膜没有表达，在蒙古沙鼠耳蜗各处表达都很弱。三个种系的鼠在耳蜗支持细胞包括Claudius细胞、Hensen 细胞和内柱细胞均有AQP4的表达，豚鼠耳蜗顶转的根细胞有较弱的表达，其它两组鼠却没有表达。

　　黄德亮[12，13]研究了小鼠的AQP1，3，4，5，7，9在内耳的表达情况，发现AQP4和AQP5无表达，AQP1在圆窗膜、螺旋韧带、内淋巴囊和内淋巴管、椭圆囊和球囊以及内耳血管壁等处被标记，AQP3在螺旋韧带、前庭唇、内和外螺旋沟、基底膜和基底膜嵴、内淋巴囊和内淋巴管、膜半规管和椭圆囊、球囊斑等处显示荧光染色，AQP7在血管纹、基底膜、前庭膜、椭圆囊和球囊及其囊斑有染色反应,而AQP9在螺旋缘、前庭唇、内外螺旋沟、前庭膜、膜半规管和球囊及其囊斑有较强染色。张勋[14]发现AQP2表达于大鼠内淋巴囊中间部柱状上皮细胞的顶质膜及顶质膜侧的细胞质中,而内淋巴管的扁平上皮及其向内淋巴囊移行中的扁平立方上皮中未见表达，在血管纹处AQP2表达于细胞质，在Corti器的支持细胞和感觉细胞以及螺旋神经节的双极神经元细胞质中可见AQP2表达，在螺旋缘的齿间细胞、前庭唇和鼓唇及螺旋凸的细胞质、盖膜和基底膜均发现有AQP2表达。从耳蜗顶回到底回以上各处表达未见明显强弱差异,在前庭膜及壶腹未见AQP2分布。陈婷[15]研究了AQP2、3、4在大鼠内淋巴囊上皮的表达情况，发现均有阳性表达。钟时勋[16]研究了豚鼠内耳AQP1、2、3、4的表达。其分布模式基本相似，主要位于耳蜗血管纹、螺旋韧带、螺旋缘、内沟细胞、外沟细胞、螺旋神经节、前庭膜及Corti器的内、外毛细胞和支持细胞，且在各个区域的表达强度也比较接近，只是AQP3在血管纹的表达较AQP1和AQP4稍弱，也较其它区域的AQP3表达弱，AQP2的表达则明显不同，它仅表达于前庭膜，在耳蜗的其余部位都没有表达。在内淋巴囊组织中，AQP1、3、4也都比较均匀地表达于上皮细胞和上皮下组织，不过AQP3的表达强度较AQP1和AQP4稍弱，而AQP2在上皮细胞和上皮下细胞的表达均呈阴性。

　　这些报道提示在动物的不同种属和内耳不同部位以及不同实验者，各AQP亚型是否表达和表达的强弱存在差异，这种差异可能与不同的物种、不同的检测方法和不同的抗体有关，但这种差异的具体原因和意义目前还不完全清楚。有些AQPs亚型可能与听力的调节有关，有些AQPs亚型可能与前庭功能的调节有关。综合起来看，无论是前庭还是耳蜗，这些AQPs分子大多集中分布于与内淋巴代谢关系密切的部位,如前庭膜、血管纹、Corti器、内淋巴囊等, 且AQP亚型表达的种类也较多。这提示尽管某一亚型可能仅分布于内耳的某些区域,但内耳可能通过AQPs各亚型的协同作用来调节内淋巴代谢。各AQPs亚型在内淋巴稳态调节中的作用及其受哪些因素的影响有待进一步研究。

　　3　水通道蛋白的调控

　　AQPs广泛存在于各种组织中，但各组织中各AQP亚型的表达及程度不尽相同，而各组织在不同生理条件下对水的通透性也很不一样，这种差异是由机体对AQPs的调控实现的，但具体调控机制不清楚。AQP的调控应该包括两个方面，一方面是对AQP量的调控，即其表达的调控;另一方面则是对AQP功能的调控，即水通透能力的调控。当然，这两方面的调控不会截然分开，大多数时候是有重叠的，一个调控因素对两方面都有作用。

　　3.1　pH值和电解质对水通道蛋白的调控

　　AQPs的基本生理功能是介导水分子的跨生物膜转运，参与渗透压梯度的形成。一般认为，与离子通道不同，水通道不存在所谓的开放或关闭的功能状态，不需要“门控”或其它调节，在生理情况下，其处于激活状态，只要存在渗透压差，水就可经水通道由低渗向高渗区转运，而且其介导的水转运方式存在较高的水渗透系数(Pf>0.01 cm/s)和较低的活化能。但Belyantseva等[20]用膜片钳记录技术对离体豚鼠和大鼠的外毛细胞进行研究时发现，流入外毛细胞的水可被细胞内的电压调节，而AQPs表达的位置正是产生电活动的外毛细胞的侧膜，提示外毛细胞的电活动和水转运可能通过AQPs在结构和功能上互相影响。这让我们注意到，水的转运以及AQPs的功能与离子的流动有关。

　　事实上，某些AQPs亚型，如AQP1和AQP6，本身就具有离子通道功能[21，22]。Sawada等[7]发现AQP1在大鼠耳蜗血管纹的中间细胞有大量表达，而血管纹的中间细胞包含了丰富的离子转运蛋白，认为在血管纹处，水的分布与大量离子转运有关，而AQP1可能在其中起重要作用。Fotiadis等[23]也发现AQP1除了是水通道外，还可能是环鸟甙酸(cGMP)门控的离子通道。AQPs除可作为离子通道与离子转运发生关系外，它本身还可被离子调控。这提示水转运和AQPs功能可能存在一定的电压门控机制。

　　pH值和Ca2+可改变AQP0的水通透能力，对细胞外第一环上的组氨酸(His 40)进行改造可以改变AQP0对pH值的敏感性，而且AQP1、AQP3、 AQP4 、AQP6的水通透能力也与 pH值有关[24-26]。Fotiadis[23]发现AQP1的羧基末端序列与Ca2+结合蛋白之间有高度同源性，提示在AQP1羧基末端区域可能存在Ca2+结合位点。在肾脏，Ca2+与AQP2的关系非常密切，其参与了AQP2在细胞内的移位以及代谢[27-29]。另外，钙还参与了二氢速留醇(dihydrotachysterol, DHT)诱导的AQP2蛋白水解作用以及乙酰胆碱、肾上腺素诱导的AQP5细胞内移位[30-33]。其它电解质如钾也参与了AQPs的调控,机制不清,可能与肾上腺皮质所分泌的醛固酮有关[34]。而pH值、K+和Ca2+对于内耳功能的影响是巨大而明显的，研究它们在内耳对AQPs的调控对于认识内耳相关疾病非常有意义。

　　3.2　渗透压对水通道蛋白的调控

　　既然水是经水通道由低渗区向高渗区转运，渗透压差是其驱动力，那么，渗透压与AQPs之间有没有联系呢?研究者对此进行了系列研究。Umenishi[35-37]发现尿毒症患者血浆渗透压高而红细胞AQP1表达低，呈明显的负相关关系,经透析治疗后则可恢复到正常值，遂提出AQP1受渗透压调节。研究发现这种调节可能是通过激活细胞外信号调节激酶(ERK)、p38激酶、c-Jun氨基端激酶(JNK)以及AQP1启动子高渗透压反应元件实现的。另外，高渗透压可促进AQP1从细胞顶质膜移位到细胞基底外侧膜，这对于细胞水通透性的变化非常有意义。

　　Ford[38]做了一个很有趣的实验，他们将肾脏皮质集合管主细胞分为两组，一组将AQP2基因敲出，而另一组则在AQP2基因敲出后又转染上AQP2基因，然后观察它们在高张和低张溶液里体积的变化情况。结果不管有无AQP2基因的存在，在高张液中均出现细胞萎缩。这很好理解，水顺渗透压差转运出了细胞。然而，在低张液中，也出现了细胞体积缩小而不是肿胀，在有AQP2基因存在的细胞其皱缩速度更快。这说明存在某种控制水进出细胞的主动机制，需要进一步探讨。Hasler等[39]用NaCl、蔗糖或尿素来增加培养液的渗透压以观察AQP2表达的变化情况，结果发现，当渗透压增加3h时，AQP2表达减少;24h时NaCl、蔗糖组AQP2表达增加，尿素组无变化。于是他们提出：(1)细胞外渗透压的短期增加通过抑制AQP2基因转录而减少它的表达;(2)细胞外渗透压的长期增加通过刺激AQP2基因的转录而增加它的表达;(3)渗透压的长期增加和蛋白激酶A(PKA)互相协同作用但相对独立地增加AQP2的表达。另外，渗透压可影响AQP2在细胞内的移动，如慢性长期的高渗透压可促进AQP2从细胞顶质膜移位到细胞基底外侧膜[40]。Kasono等[41]从基因水平阐述了渗透压对AQP2表达的调节机制。

　　3.3　水通道蛋白的激素调节

　　类固醇激素通常用于治疗内耳疾病，但其机制不清，Fukushima[42-43]对此进行了初步的研究。他将地塞米松分别注射到大鼠腹腔或鼓室，然后观察AQPs亚型在内耳表达的变化情况。发现腹腔注射地塞米松后，内淋巴囊AQP3 mRNA明显增加，且有剂量依赖性，AQP1 mRNA没有变化，耳蜗AQP5 mRNA减少，但没有量效关系，耳蜗、内淋巴囊的其它AQPs没有变化;而鼓室注入地塞米松后，耳蜗AQP1 mRNA明显增加且有剂量依赖性，AQP5 mRNA减少，但没有量效关系，耳蜗、内淋巴囊的其它AQPs则没有变化。Kitahara[44]将地塞米松注入到大鼠内淋巴囊，发现AQP3 mRNA 在同侧耳蜗的表达明显增加，并且有剂量、时间依赖性。这些结果说明，类固醇激素可改变某些AQPs在内耳的表达，参与大鼠内耳的水代谢，其具体的分子机制有待进一步研究。

　　抗利尿激素(antidiuretic hormone，ADH)与膜迷路积水的关系早已得到确认，故ADH与AQP2的关系被广泛研究。ADH的作用是通过V2受体介导的，于是Takeda等[45]做了两个实验来研究ADH-V2受体拮抗剂OPC-31260对豚鼠内淋巴积水模型的影响和对AQP2 mRNA在内耳表达的影响。在实验中，他们先将大鼠内淋巴囊予以破坏，然后将实验动物随机分为三组：不灌注组，鼓阶生理盐水灌注组以及鼓阶0.3% OPC-31260灌注组，同时设立未破坏内淋巴囊的正常对照组，然后对前庭膜长度(IR-L)与鼓阶横截面积(IR-S)的比值的增加量进行测定评估。结果显示实验组的IR-L明显大于对照组，但三个实验组之间没有区别。不灌注组和生理盐水灌注组的IR-S 高于正常对照组，而0.3% OPC-31260灌注组的IR-S明显低于不灌注组和生理盐水灌注组。说明在一定条件下，OPC-31260可拮抗膜迷路积水的出现。他们在另一个实验中，分别给大鼠静脉注射水和OPC-31260，然后定量比较内耳AQP2 mRNA和β-actin mRNA (MAQP2/Mbeta-actin)的表达率，结果为静脉注射OPC-31260组耳蜗和内淋巴囊的MAQP2/Mbeta-actin表达减少。Sawada[46]也发现腹腔注射ADH后耳蜗和内淋巴囊的AQP2 mRNA 表达水平明显高于对照组，说明ADH可以调节AQP2在内耳的表达，水代谢可通过ADH-AQP2系统进行调节。其调节的分子机制如何，是否与其在肾脏的调节机制一致，目前还不清楚。

　　除类固醇激素和ADH外，机体水潴留、肾上腺盐皮质激素、细胞因子、病理生理状态等因素也可能参与AQP的调节。盐皮质激素对培养的小鼠皮质集合管细胞株(mpkCCDC14)的AQP2表达有双重调节作用，在给予短期刺激(≤24h)时，醛固酮可使AQP2表达降低，长期刺激则增加AQP2的表达[47]，在盐皮质激素缺乏大鼠的肾内髓质AQP2表达显著增加[48]，糖皮质激素缺乏时则轻度增加[49]。二氢速留醇可使大鼠血钙增加,肾脏皮质和髓质AQP2表达下降，但AQP2 mRNA的表达却没有改变[30-31]。乙酰胆碱和作用于ɑ1受体的肾上腺素也可通过Ca2+ 来诱导AQP5在细胞内的移位[32-33]。至于这些因素在内耳对AQPs的影响目前还未见文献报道。

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