平阳霉素局部注射对鼻息肉病息肉组织病理学的影响

　　作者：杨妙丽　张向红　邹纪东　李宝树　任晓勇　石季 作者单位：西安交通大学医学院第二附属医院耳鼻咽喉科，陕西西安 710004;山东省人民医院耳鼻咽喉科，山东济南 250012

　　【摘要】目的 通过观察平阳霉素治疗前后鼻息肉病息肉组织的病理变化情况，探讨平阳霉素治疗鼻息肉病的机制。方法 应用末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法(TUNEL法)检测凋亡细胞，与相邻连续的HE染色片对位对照观察嗜酸性粒细胞的凋亡情况。结果 平阳霉素治疗前鼻息肉组织嗜酸性粒细胞表达显著高于正常下鼻甲(P<0.01);治疗后鼻息肉组织中的嗜酸性粒细胞表达明显低于治疗前(P<0.01);治疗后鼻息肉组织中嗜酸性粒细胞的凋亡指数高于治疗前(P<0.01)。结论 嗜酸性粒细胞是鼻息肉病息肉组织中主要的浸润炎细胞;平阳霉素可通过促进嗜酸性粒细胞凋亡达到治疗鼻息肉病的目的。

　　【关键词】 平阳霉素; 鼻息肉病; 病理学影响

　　Pathological effects on nasal polyposis tissue　after bleomycin A5 local injection

　　Yang Miaoli, Zhang Xianghong, Zou Jidong, Li Baoshu, Ren Xiaoyong, Shi Ji

　　(Department of Otorhinolaryngology, the Second Affiliated Hospital, Medical School of　Xian Jiaotong University, Xian 710004; Department of Otorhinolaryngology,Shandong Province Peoples Hospital, Jinan 250012, China)

　　ABSTRACT: Objective To study the pathological effects on nasal polyposis tissue after bleomycin A5 local injection. Methods Totally 119 cases of nasal polyposis specimen obtained before and after treatment with bleomycin A5 were studied with terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick endlabeling(TUNEL). Results The number of eosinophils in nasal polyposis specimen before treatment was significantly higher than that after treatment (P<0.01) and normal inferior turbinate concha mucosa (P<0.01). The apoptosis index(AI) of eosinophil after treatment was significantly higher than that before treatment (P<0.01). Conclusion Eosinophil is the main infiltration cell in nasal polyposis tissue. Bleomycin A5 could cure nasal polyposis by promoting eosinophil apoptosis.

　　KEY WORDS: bleomycin A5; nasal polyposis; pathological effect

　　鼻息肉病为鼻部常见病，其治疗有一定难度，息肉复发是临床难题之一。目前认为，嗜酸性粒细胞是鼻息肉组织中主要浸润炎细胞，嗜酸性粒细胞及其分泌的多种细胞因子在鼻息肉的生长过程中扮演着重要角色。本研究旨在通过观察平阳霉素局部注射治疗前后的鼻息肉病患者息肉组织标本中炎细胞数量变化特别是嗜酸性粒细胞凋亡情况，探讨平阳霉素治疗鼻息肉病的机制[1]。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象 选取本院2001年9月至2006年9月门诊鼻息肉病患者119例，男62名，女57名，年龄最小25岁，最大82岁，平均年龄56岁。根据1997年海口标准分型[2]：2型64例(其中1期19例，2期21例，3期24例)，3型55例。于治疗开始前1个月完全停用抗生素和激素类药物。常规胸部影像学检查，排除有肺部疾患患者。

　　1.2 治疗方法 术前胸部X线检查及血尿常规化验均正常者，可接受治疗。取平阳霉素(天津太河制药有限公司生产)1支(8mg)用20mL/L利多卡因4mL和生理盐水4mL溶解，行息肉内注射。首次每侧注射2mg，观察24h，如无不良反应，从第2次起每侧注射4mg，每周1次。用细长针头自息肉前端进针，边推药边缓缓向后推进，以注药后息肉变苍白、肿胀为佳。每5-7d重复注射1次，5次为一疗程。根据1997年海口疗效评定标准[2]，治愈57例，好转62例，无效0例。治愈率36.8%，好转率63.2%。对于好转的62例，继续行息肉摘除术治疗，术中出血(术前及术中均未用止血剂)<30mL。治疗后随访6-18个月，未见复发。

　　1.3 标本处理 分别于平阳霉素局部注射治疗前及一个疗程结束后1周取鼻息肉病患者鼻息肉组织。另取108例中隔矫正术者下鼻甲黏膜组织作正常对照。取材后，标本迅速用10%(体积分数)甲醛固定，常规石蜡包埋，备用。每例标本均连续切片2片，1片进行原位细胞凋亡检测，另1片作HE染色，以计数嗜酸性粒细胞并与原位细胞凋亡检测片对照。

　　1.4 TUNEL法检测细胞凋亡 细胞凋亡检测试剂盒1(POD)购自武汉博士德生物技术有限公司。操作按说明：①石蜡切片常规脱蜡入水;②新鲜配制3%(体积分数)乙酸室温10min，蒸馏水洗2min×3;③1∶200稀释Proteinase K消化8min;④每张切片取TdT、DIGdUTP各1μL加入18μL标记缓冲液中，37℃标记2h;⑤封闭液50μL室温30min，不洗;⑥用封闭液1∶100稀释生物素化地高辛抗体50μL/片，37℃ 30min;⑦1∶100稀释辣根过氧化物酶标记链霉卵白素液50μL/片，37℃ 30min;⑧DABH2O2液室温、显微镜下控制显色15min左右;⑨苏木素复染细胞核，常规脱水、透明、中性树胶封片。

　　(注：③-⑦每步完后均用0.1mol/L TBS液充分洗3min×2次)。

　　1.5 嗜酸性粒细胞凋亡的判定标准 凋亡阳性细胞核呈棕褐色染色。与相邻的HE染色片作对位对照观察，辨别凋亡阳性嗜酸性粒细胞。采用双盲法高倍镜(×400)下随机计数10个视野，分别计数凋亡阳性和阴性的嗜酸性粒细胞，并计算嗜酸性粒细胞凋亡指数(apoptosis index, AI)。AI=凋亡阳性嗜酸性粒细胞数/嗜酸性粒细胞总数×100%。

　　1.6 统计学分析 应用SPSS 11.0统计软件对数据进行统计分析，治疗前后炎细胞数量的变化采用配对t检验，治疗组与对照组间的比较采用独立样本t检验。

　　2 结果

　　2.1 治疗前后鼻息肉病息肉组织中炎细胞的表达 治疗前、后鼻息肉组织及对照组下鼻甲黏膜中均有数量不等的嗜酸性粒细胞、浆细胞、淋巴细胞存在。治疗前鼻息肉组织与对照组间嗜酸性粒细胞、淋巴细胞的数量均存在明显差异(P<0.05)，浆细胞在两组间无差异(P>0.05)。治疗后鼻息肉组织中嗜酸性粒细胞、淋巴细胞的数量比治疗前明显减少，具有显著性差异(P<0.01)，浆细胞数量也有减少，但无统计学意义(P>0.05，表1)。

　　表1 鼻息肉病治疗前后和正常对照组炎细胞数量的比较(略)

　　Table 1 Effect of bleomycin treatment on inflammatory cells in nasal polyp

　　*P<0.05 vs. control; △P<0.01 vs. before treatment

　　2.2 治疗前后鼻息肉病息肉组织中嗜酸性粒细胞凋亡的改变 用TUNEL法检测，阳性细胞(凋亡细胞)的细胞核呈棕褐色染色。

　　嗜酸性粒细胞凋亡指数治疗前为(20.53±7.66)%，治疗后为(44.47±8.97)%。由配对t检验得t=3.602，P<0.01，显示平阳霉素治疗前后嗜酸性粒细胞凋亡指数有极显著性差异(图1、2)。

　　图1 鼻息肉病治疗前嗜酸性粒细胞凋亡情况(略)

　　Fig.1 Inflammatory cells in nasal polyp before treatment　there were more eosinophile granulocytes and fewer apoptotic cells than the controls (TUNEL ×400)

　　图2 鼻息肉病治疗后嗜酸性粒细胞凋亡情况(略)

　　Fig.2 Inflammatory cells in nasal polyp after bleomycin treatment　eosinophile granulocytes were significantly decreased and apoptotic cells were significantly increased in nasal polyp after treatment with bleomycin (TUNEL ×400)

　　3 讨论

　　3.1 鼻息肉病息肉组织中炎细胞分布的特点及意义 鼻息肉病并不是近年来提出的一个新概念，目前国内外学者对鼻息肉进行了大量研究，但大多未对鼻息肉组织的来源予以区别，因此对鼻息肉组织中炎细胞浸润情况的研究结果有较大差异。1964年，Okuda等的研究结果为：在奥地利，以嗜酸性粒细胞浸润为主的鼻息肉占85%，而在日本占26%，另有报道，在芬兰占93.6%，德国占93.3%。袁晓培等[3]发现鼻息肉组织中各种浸润的炎细胞中，多以浆细胞和淋巴细胞浸润为主，而以嗜酸性粒细胞浸润为主的约占28.1%。藤霞娟等[4]通过对42例鼻息肉组织HE染色切片观察发现，嗜酸性粒细胞浸润为主的占28.57%，淋巴细胞浸润为主的占71.4%。朱华斌等[5]研究认为鼻息肉属上气道的慢性炎症性疾病，其组织中有大量嗜酸性粒细胞浸润，而嗜酸性粒细胞浸润的程度与鼻息肉的预后密切相关。

　　近年本院存档鼻息肉组织病理切片提示，鼻息肉的局部组织中多以淋巴细胞、浆细胞浸润为主，而鼻息肉病的局部组织中多以嗜酸性粒细胞浸润为主。这些组织病理学差异也进一步提示欧洲及亚洲地区鼻息肉与鼻息肉病的患病率有所不同。欧洲地区鼻息肉病的患病率较高，而亚洲地区鼻息肉的患病率较高。此种差异可能由环境因素和人种因素所致。但近来日本报道嗜酸性粒细胞浸润为主的鼻息肉逐年增加，提示环境因素可能起更为重要的作用。

　　本研究对119例鼻息肉病息肉组织和108例正常对照组的下鼻甲黏膜进行了炎细胞分类计数，发现嗜酸性粒细胞在两组有显著性差异(P<0.01)，淋巴细胞在两组也有显著性差异(P<0.05)，而浆细胞在两组差异无统计学意义(P>0.05)。表明鼻息肉病是以嗜酸性粒细胞浸润为主，进而证明了嗜酸性粒细胞在鼻息肉病发病过程中可能起着重要的作用。

　　3.2 平阳霉素对鼻息肉病息肉组织中嗜酸性粒细胞表达的影响及意义 嗜酸性粒细胞作为介质细胞释放某些细胞因子而导致上皮细胞和黏膜组织的损害，从而引起炎症的发生发展。同时，这些细胞因子，特别是IL5等又抑制了嗜酸性粒细胞的凋亡 [6]。从而大大增加了鼻息肉组织的生成以及息肉的复发。因此，我们认为加强鼻息肉组织中嗜酸性粒细胞的凋亡力度是目前临床治疗鼻息肉或阻止其复发的一个关键。

　　平阳霉素是我国自行研发的一种抗肿瘤抗生素，它能抑制癌细胞DNA的合成和切断DNA链，影响癌细胞代谢功能，促进癌细胞变性、坏死，并对增殖细胞具有杀伤和阻滞作用，这双重效应最终引起细胞凋亡。细胞凋亡的特征是DNA分解，产生DNA单链或双链缺口，在末端脱氧核糖核酸转移酶的作用下，两种缺口3′OH末端都可以用地高辛核苷酸标记，再用酶标记地高辛抗体予以显示。本次实验结果显示：鼻息肉组织中凋亡细胞主要为嗜酸性粒细胞，这就说明鼻息肉组织中注射了平阳霉素后可能使得其中的嗜酸性粒细胞的DNA链发生了断裂，因而提示了平阳霉素治疗鼻息肉病的可能机制所在。

　　细胞凋亡在炎症的消散、减退方面起着主要作用[7]。深入研究鼻息肉组织中嗜酸性粒细胞的凋亡机制不仅有助于阐明鼻息肉病的发病机制，而且更有助于开拓新的治疗途径。通过本组观察以鼻腔局部注射平阳霉素来治疗鼻息肉病确实可在临床上达到使息肉组织在短时间内迅速缩小或消失，其可能的机制是使嗜酸性粒细胞核中的DNA链发生断裂，从而使嗜酸性粒细胞发生凋亡，进而使鼻息肉得到治愈。

　　局部注射小剂量平阳霉素治疗鼻息肉病，具有操作简单、疗效迅速确切、毒副作用小、并发症少、可以门诊治疗的优点，尤其适用于老年人及不适于手术治疗、术后复发的患者[8]。

　　【参考文献】

　　[1]张向红,邹纪东,李宝树,等. 平阳霉素局部注射对鼻息肉病息肉组织 [J]. 中嗜酸性粒细胞凋亡的影响, 临床耳鼻咽喉科杂志, 2004, 18(5):279281.

　　[2]中华医学会耳鼻喉科分会,中华医学会耳鼻喉科杂志编辑委员会. 慢性鼻窦炎鼻息肉临床分期及内窥镜鼻窦手术疗效评定标准(1997,海口) [J]. 中华耳鼻咽喉科杂志, 1998, 33:134135.

　　[3]袁晓培，于德林，虞有智. 鼻息肉组织中T细胞亚群的分部及2种白细胞介素表达的初步研究 [J]. 中华耳鼻咽喉科杂志, 2000, 35:363366.

　　[4]藤霞娟，潘巳奋，叶燕芬. 鼻息肉的组织细胞学变化和形成机理探讨 [J]. 上海第二医科大学学报, 2001, 21:165167.

　　[5]朱华斌，冯云海，殷善开. 布地奈德对鼻息肉中RANTES的影响 [J]. 中国耳鼻咽喉颅底外科杂志, 2007, 13(2):103105.

　　[6]Desreumaux P, Janin A, Dubucquoi S, et al. Synthesis of interleukin5 by activated eosinophilsin patients with eosinophilic heart diseases [J]. Blood, 11993, 82:15531560.

　　[7]刘争，高起学，张俊，等. Bclx1和Bcl2在鼻息肉组织嗜酸性粒细胞中的表达 [J].中华耳鼻咽喉科杂志, 2001, 36:9093.

　　[8]张向红,李宝树. 平阳霉素治疗老年患者鼻良性病变及肿瘤的体会 [J]. 西安交通大学学报(医学版), 2000, 3:287389.