水通道蛋白1在鼻息肉中的表达及其调节机制

    作者：姚利    作者单位：北京大学深圳医院耳鼻喉科, 广东 深圳 518036     【摘要】  研究水通道蛋白1(aquaporin1, AQP1)在鼻息肉组织中的表达,探讨其与鼻息肉水肿形成及发展的关系。方法：取鼻中隔偏曲矫正术患者下鼻甲黏膜30例和鼻息肉组织60例。鼻息肉组Ⅱ型1期10例, 2期15例, 3期25例，Ⅲ型10例。采用免疫组织化学检测AQP1在不同类型及不同临床分期鼻息肉和下鼻甲黏膜组织中的表达及在不同类型鼻息肉组织中的表达。结果：（1）鼻息肉上皮层AQP1阳性细胞数显著高于下鼻甲黏膜(Ｐ＜0 01); 不同分型分期鼻息肉上皮层AQP1的阳性细胞数又有差异,Ⅱ型3期和Ⅲ型鼻息肉显著低于Ⅱ型1期鼻息肉(Ｐ＜0 01); 而在鼻息肉血管内皮及腺体细胞中的AQP1的表达明显高于下鼻甲(Ｐ＜0 01); （2）Ⅱ型3期和Ⅲ型鼻息肉血管内皮中AQP1阳性细胞数显著高于Ⅱ型1期鼻息肉和下鼻甲黏膜上皮下组织(Ｐ＜0 01)。结论：AQP1在鼻息肉组织中的异常表达可能与鼻息肉的发生和发展密切相关, 具体机制有待进一步研究。

    【关键词】  水通道蛋白1 鼻息肉 免疫组织化学

    ［ABSTRACT］  Objective: To explore the expression and distribution of aquaporin1(AQP1)  in the formation and development of nasal polyps. Methods: Thirty cases of normal inferior turbinates and sixty cases of nasal polyps were enrolled in this study. In the nasal polyp group, there were 10 cases of type II phase 1, 15 cases of type II phase 2, 25 cases of type II phase 3, and 10 cases of type III. Expression of AQP1 in both groups was determined by the Elivision plus immunohistochemistry technique. Results: (1) Positive AQP1 cells in the epithelial cell layer of nasal polyps were significantly fewer than those of the inferior turbinate (P＜0.01) and   positive AQP1 cells of nasal polyps of the type Ⅱ phase 1 were significantly more than those of the type  Ⅲ or type Ⅱ phase 3 (P＜0.01). (2)  Positive AQP1  cells in both the vessel endothelium and the glandular epithelium from the  type Ⅲ, type Ⅱ phase 3 of nasal polyps were significantly more than those from the type Ⅱ phase 1 nasal polyps and the inferior turbinate (P＜0.01). Conclusion: AQP1 might play an important role in the formation and development  of nasal polyps. Exploration of the regulation of  AQP1 contributes toward evaluating the pathogenesis of nasal polyps.

    ［KEY WORDS］  Aquaporin1; Nasal polyps;  Immunohistochemisty

    鼻息肉是耳鼻喉科常见病，发病率较高，复发性强［1］。临床上最常见的病理类型是水肿型(约占总数的85% 90%)，其具体发生机制尚不明确［2］。现认为鼻息肉的发病是多因素、多步骤的过程，涉及众多复杂的病理机制。

    AQP1是上世纪80年代末由Agre发现的第一个水通道，被称为原型水通道。AQP1在人体内分布广泛，存在于不同的组织器官中，如与液体被吸收和分泌有关的肾小管、髓袢降支薄壁段、脉络膜丛、唾液腺上皮、支气管、肺泡上皮、毛细血管内皮等。在淋巴管和黏膜下毛细血管中的AQP1能促进吸收的水迅速进入淋巴管和毛细血管床。可见AQP1参与人体内多种生理功能调节，AQP1表达和功能异常与某些疾病的分泌增多及水肿密切相关［3］。

    1  材料与方法

    1.1  临床资料  本组标本取自2004至2005年北京大学深圳医院及北京大学第三医院住院行鼻内镜手术的慢性鼻窦炎鼻息肉患者90例，随机分组：①鼻息肉组60例，其中男33例，女27例，17 52岁，平均35岁，其中Ⅱ型Ⅰ期10例，Ⅱ型2期15例，Ⅱ型3期25例，Ⅲ型10例；②对照组：同一时期接受鼻中隔矫正术的患者，取下鼻甲黏膜共30例，其中男20例，女10例，18 36岁，平均31岁。

    排除标准：1个月前全身或鼻腔局部使用过激素、抗组胺以及抗生素药物；合并有变应性鼻炎、支气管哮喘或合并有严重全身疾病者。

    1.2  实验方法

    1.2.1  免疫组化染色材料  AQP1蛋白单克隆抗体，鼠抗人单克隆抗体为美国Santa Cruz公司产。Elivision Plus试剂盒为福州迈新公司产。

    1.2.2  方法  标本经10%福尔马林液固定，石蜡包埋，连续切片，5?μm厚，HE染色和Elivision Plus二步法免疫组化染色。脱蜡、入水，3%甲醇过氧化氢液室温处理切片，微波修复抗原，滴加一抗AQP1单克隆抗体（1∶200）于切片上，4?℃过夜，严格按照Elivision Plus二步法免疫组化染色操作，DNB显色，苏木精复染，脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，显微镜下观察。每批均以已知人肾曲小管阳性切片为阳性对照，用PBS液代替一抗同步染色作为阴性对照。

    1.3  结果判断  采用双盲法，每张切片由两位病理医生分别判定计数，两人计数相差10%以上重新计数。AQP1蛋白定位于细胞浆内，棕黄色或棕红色颗粒为阳性细胞。每张切片在×200倍镜下随机选择5个视野，计数鼻息肉中的阳性细胞，取其平均数作为阳性细胞表达数（±s）。

    1.4  统计学处理  应用SPSS10.0软件包,两组均数比较用t检验，多组均数比较用方差分析。

    2  结  果

    2.1  病理结果  阴性对照均不着色，阳性对照片中见人肾曲小管胞浆呈明显棕黄色。下鼻甲黏膜AQP1阳性表达主要位于黏膜上皮细胞和黏膜固有层腺体。在毛细血管内皮及血窦内皮表达较弱。在鼻息肉组织中AQP1蛋白多位于上皮下腺体及毛细血管、血窦内皮细胞胞浆中，染色较强，而在上皮细胞中则呈弱阳性表达或阴性表达（图1 5）。根据Kakoi分型［5］：水肿型占89%，腺囊泡型占8%，纤维型占3%。

    鼻息肉Ⅲ型，黏膜上皮细胞中AQP1蛋白多阴性表达，黏膜下部分嗜酸性粒细胞AQP1表达阳性（×400）

    鼻息肉Ⅲ型，AQP1蛋白在较多血管内皮细胞中呈阳性表达（×200）鼻息肉Ⅱ型3期，AQP1蛋白在较多腺样细胞中呈阳性表达（×200）

    鼻息肉Ⅱ型1期，AQP1蛋白在上皮层呈阳性表达，血管腺体多呈弱阳性表达（×200）

    2.2  AQP1蛋白在鼻息肉与下鼻甲黏膜中的分布  AQP1蛋白在鼻息肉与下鼻甲黏膜的表达见表1。鼻息肉组织和下鼻甲黏膜中AQP1蛋白在黏膜上皮、血管内皮以及腺体表达的阳性细胞数差异有统计学意义。

    2.3  AQP1蛋白在鼻息肉不同组织类型中的表达  见表2。 水肿型鼻息肉中AQP1蛋白在血管内皮及腺体中的阳性细胞数明显高于腺囊泡型及纤维型鼻息肉, 差异有统计学意义。

    2.4  AQP1蛋白在鼻息肉不同临床分型分期的表达  见表3。由表3可见，鼻息肉临床分型分期中AQP1蛋白在Ⅱ型1期血管内皮阳性细胞数明显少于Ⅱ型3期及Ⅲ型的阳性细胞数，差异有统计学意义(P＜0.01)。Ⅱ型1期腺体的阳性细胞数明显少于Ⅱ型3期，差异有统计学意义(P＜0.01)。但同Ⅲ型的阳性细胞数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。Ⅱ型1期上皮中的阳性细胞数分别大于Ⅱ型3期及Ⅲ型，差异有统计学意义(P＜0.01)。

    3  讨  论

    鼻息肉是一种以鼻腔局部黏膜肿胀为特征的良性病变组织，以往多认为鼻息肉的水肿是肥大细胞释放的组胺介质的作用所致［6］; 也有学者认为是鼻黏膜血管通透性增加导致了鼻息肉组织水肿［7］。鼻息肉作为一种独特的炎性水肿组织，其水肿的形成可能存在多种机制［8］。

    目前在人类和哺乳动物身上共发现水通道蛋白有10个亚型，（AQP0、AQP19）分布于多个组织器官，其基本功能是介导自由水分子的跨生物膜转运，活化能较低（Ea＜5?kcal·mol/L），速度快，不受质膜分子组成、温度等的影响，只要存在渗透压梯度或流体静力压不同，就可以有水分子顺梯度通过水通道蛋白［9,10］。因而它对水转运的调节作用也愈来愈受到人们的关注。

    AQP1是第一个被鉴定的水通道蛋白，基因定位于7P14，其基本结构是一个单肽链,含有6个跨膜区域和5个环，其中B、E环含有天冬酰氨一脯氨酸一丙氨酸（AsnProAla NPA）重复关联序列，显著疏水。AQP1的高级结构为一个四聚体，其以4个单体聚合，每个单体允许自由水通过，每个单体单独施行功能。这种转运也受水通道蛋白表达水平的显著影响，因此水通道蛋白的表达必然与机体的生理病理状态有密切关系［11,12］。

    我们的研究表明，在正常下鼻甲组织中AQP1的阳性表达主要位于黏膜上皮细胞和黏膜固有层的腺体、粘液腺细胞胞浆中，在毛细血管内皮及血窦内皮表达较弱。鼻息肉组织中强染色多位于上皮下腺体及毛细血管、血窦内皮细胞。AQP1蛋白在鼻息肉和下鼻甲黏膜组织的表达差异有统计学意义（P＜0.01)。表明在鼻息肉组织中存在AQP1蛋白的异常表达。从蛋白质水平证明了AQP1基因的异常与鼻息肉的发生密切相关。近年的研究也发现，水通道蛋白的亚型在鼻息肉组织也有分布［13］，提示水通道蛋白可能在鼻息肉中广泛分布。与本研究相类似，Verkman等［9］发现，小鼠肺毛细血管内皮细胞或肺泡上皮缺乏AQP1时，肺泡毛细血管间水的渗透下降90%，Chanranhan等［14］也认为，AQP1参与了呼吸道黏膜下腺的液体分泌，可见AQP1蛋白的异常表达对水的转运有重要影响。

    AQP1在鼻息肉腺体和血管内皮细胞的过表达可能与鼻息肉形成有关。本组资料显示，鼻息肉中水肿型AQP1蛋白在血管内皮及腺体表达的阳性细胞数显著高于腺囊泡型及纤维型（P＜0.01）。提示在不同组织类型鼻息肉的发生过程中，组织水肿愈明显，则AQP1蛋白表达阳性数越高，一定程度上反映了AQP1的基因失调与水肿型鼻息肉的产生有关。

    我们在鼻息肉早期病变过程中发现，黏膜上皮多为假复层柱状上皮，随着病变加重，出现上皮排列紊乱，部分被复层鳞状上皮及无纤毛的扁平上皮取代，腺体增生分泌亢进，血管增生扩张。实验发现鼻息肉Ⅱ型3期和Ⅲ型中AQP1蛋白在血管内皮阳性细胞显著多于Ⅱ型1期的鼻息肉组织（P＜0.01），Ⅱ型3期腺体样细胞中阳性细胞显著多于Ⅱ型1期（P＜0.01），说明随着病变程度的进展，AQP1蛋白表达增加。同时也发现在黏膜上皮中随着病变的进展，AQP1表达出现下降趋势。因而推测早期AQP1蛋白在息肉黏膜上皮中的较多表达可能是细胞对所接受的内外致病因子的反应，使AQP1基因合成加速，促使AQP1蛋白高表达，加快水的跨膜转运，以尽量维持组织内外的水转运平衡，减少细胞损伤。随着致病因子继续作用，当上皮细胞数量损失到一定程度，同时随着异常增殖腺体和血管内皮细胞上AQP1蛋白的过表达，使上皮残留的AQP1无法承担超负荷水转运，使得组织间液大量积聚，息肉的逆转能力下降。而Ⅲ型腺体样细胞中AQP1蛋白的表达同Ⅱ型1期中没有显著性差异，可能是由于Ⅲ型患者由于多次手术，导致腺体破坏，构筑数目减少有关。故对AQP1蛋白动态观察可预测鼻息肉的发展趋势和程度。

    AQP1在鼻息肉的发生过程中可能并非孤立地发挥作用，它有可能与Na+K+ATP酶协同，通过促进跨上皮离子的转运，形成渗透梯度，产生对渗透水转运的驱动力［15］。通过研制水通道蛋白抑制因子来抑制功能亢进及表达过多的水通道蛋白，或通过控制水通道蛋白来平衡液体的分泌和吸收，可能为鼻息肉治疗及防止术后复发提供一种新的治疗思路和手段。

【参考文献】 ［1］ 杨蓓蓓. 内窥镜鼻窦外科鼻-鼻窦鼻息肉病与变态反应［J］. 国外医学耳鼻喉科学分册，1995，19（2）：7579.

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［3］ Towne JE, Harrodk S, Krane CM, et al. Decreased expression of aquaporin(AQP)1 and AQP5 in mouse lung after acute viral infection［J］. Am J Respir Cell Mol Biol, 2000， 22(1):3444.

［4］ 中华医学会耳鼻咽喉科学分会，中华耳鼻咽喉科杂志编辑委员会. 慢性鼻窦炎鼻息肉临床分型及内窥镜鼻窦手术疗效评定标准（1997，海口）［S］. 中华耳鼻咽喉科杂志，1998，33：134.

［5］ Kakoi H, Hiraide F. A histological study of formation and growth of nasal polyps［J］. Acta Otolargyngol, 1987, 103:137144.

［6］ 杨继红, 董震. 鼻息肉病的细胞病理学研究［J］.国外医学耳鼻咽喉科学分册，1999，23（2）：7779.

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［9］ Verkman AS, Vanhoek AN, Ma T, et al. Water transport across mammalian cell membranes［J］. Am J Physiol, 1996, 270(1pt1):c1230.

［10］ Preston GM, Carroll TP, Guggino WB, et al. Appearance of water channels in xenonpusoocytes expressing red cell CHIP28 protein［J］. Science, 1992， 256(5055):385387.

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