乌鲁木齐市特教学校重度感音神经性聋GJB2和线粒体基因常见突变调查

作者：张劲,李琦【摘要】目的　调查新疆乌鲁木齐市聋哑学校重度感音性耳聋分子流行病学情况。方法　对194例聋哑学生进行临床资料采集， 外周静脉血抽取。血样经DNA提取， 进行GJB2 235delC突变、 线粒体DNA 12SrRNA A1555G突变的检测。结果　194例聋哑学生中， GJB2 235delC纯合突变、 235delC杂合突变携带率分别为为5.67%(11/194)、5.67 %（11/194）， mtDNA A1555G点突变检出率为9.28% （18/194）。GJB2 235delC在汉族、 维族、 回族聋哑学生中的等位基因频率分别为9.51% （27/284）、 6.0% （3/50）、 3.13% （1/32）；携带mtDNA A1555G点突变的聋哑学生16人为汉族、 1人为维族、 1人为回族。结论　新疆三个主要民族聋哑学生群体中GJB2 235delC、 A1555G突变检出率均以汉族最高， 但三个民族的突变检出率经统计学比较无显著性差异。新疆地区聋哑学生的GJB2 235delC突变检出率在全国处于较低水平， 新疆地区聋哑学生的A1555G突变检出率高。 【关键词】  耳聋；　GJB2基因；　线粒体DNA；　突变    　　耳聋是人类最常见的致残原因之一，严重影响着人类的生活质量。重度感音神经性聋多表现为语前聋，语前聋约 50% 与遗传有关， 在新生儿中发病率约为 1/800 ～ 1/1 000［1］。随着分子遗传学技术在感音神经性耳聋（sensorineural hearing loss， SNHL）诊断中的广泛应用， 遗传因素在SNHL的病因和发病中日益受到重视。利用聋病的分子诊断技术来发现导致耳聋的原因及引起耳聋的高危因素并进行干预进而达到防聋、 指导康复、评估耳聋预后及减少耳聋发生率， 将成为提高人口素质的重要举措。研究表明相当部分的 SNHL 发病与 GJB2 235delC 和线粒体 DNA（mitochondrial DNA, mtDNA） A1555G有关。这两种基因突变的发生频率在中国不同地区、不同民族之间有很大差异［2］。新疆维吾尔自治区地域广阔，聚居民族多， 乌鲁木齐特殊教育学校作为新疆最大的从事聋儿康复、 教育的专门机构，其耳聋患者的构成有一定的代表性。本研究作为解放军总医院在全国范围开展分子流行病学调查的一部分，旨在了解多民族聚居区的耳聋分子流行病学， 为临床上进行大规模的耳聋基因诊断创造良好的基础。

    1　材料与方法

    1.1　一般资料　乌鲁木齐市特教学校聋哑学生194人。男99人，女95人。年龄6 ～ 23岁， 平均年龄（14.81 ± 3.57）岁。 民族： 汉族142例、 维吾尔族25例、 回族16例、 哈萨克族6例、 蒙古族2 例、 满族1例、 土家族1例、 乌兹别克族1例。经病史调查、全身及耳鼻咽喉常规检查、纯音测听检查明确所选的194例聋哑学生均为双侧重度或极重度非综合征性耳聋。191例为散发病人，3例有耳聋家族史。 聋前有明确氨基糖甙类抗生素应用史者46例，其中汉族38例，回族5例，维吾尔族2例，哈萨克族1例。

    1.2　调查方法　采用问卷调查形式， 初筛调查先期发放制式“耳聋调查表”， 由学生家长填写有关信息， 同时填写知情同意书。对回答不明确者通过预约家长问询或电话联系的方式完善相关信息。调查表内容由聋儿基本信息、 耳聋史、 家族史、聋儿出生史、 个人史（聋前传染病、 耳毒性药物应用情况、头部是否受外伤等）、 体检（全身及专科查体）等部分组成。包括对参选对象的遴选（按照有关标准纳入、 排除）等工作均由经过培训的专业人员完成。对全部研究对象由专业人员进行纯音测听检查。所有耳聋患者均抽取静脉血3 ～ 5 ml，用以提取基因组DNA。

    1.3　PCR扩增及限制酶切技术　应用Prev-DAF线粒体DNA A1555G突变检测试剂盒对194例SNHL患者进行线粒体mtDNA 12SrRNA A1555G点突变检测，并应用限制性酶切反应进行GJB2基因235delC突变检测［3,  4］。

    1.4　统计学分析　统计学处理使用Stata 7.0软件包。GJB2 235delC、 A1555G三个人数较多民族携带率的比较采用卡方检验多个率的比较， P < 0.05为差别有显著性。

 2　结　果

    　　不同民族GJB2 235delC和mtDNA 12SrRNA A1555G的发病情况见表1。乌鲁木齐特殊教育学校194人中11例（5.67%）有GJB2 235delC纯合突变， 11例（5.67%）存在GJB2 235delC杂合突变； 其中汉族聋哑学生GJB2 235delC携带率为11.97%。GJB2 235delC的等位基因频率在汉族、维族、 回族聋哑学生组分别为9.51%（27/284）、 6.0%（3/50）、3.13%（1/32）。 18例（9.28%）存在mtDNA A1555G点突变， 其中16例为汉族聋哑学生， 1例为维族聋哑学生， 1例为回族聋哑学生。新疆人数最多的三个民族携带GJB2 235delC纯合突变、杂合突变及mtRNA A1555G情况见图1。三个民族GJB2 235delC、 mtRNA A1555G检出率比较无统计学意义（GJB2　x2 = 1.9667 P  > 0.05， A1555G x2 = 1.5203 P > 0.05）。

    3　讨　论

    　　我国是一个多民族国家，幅员广阔，人口众多，在边疆地区各民族间有“大杂居、 小聚居”的特性：一方面， 人口来源复杂， 不同人种经过长时间的融合交流， 增加了中国人口总体基因的复杂性；另一方面西北等地区的少数民族长期处于封闭状态，造成了中国人基因在地域上可能存在的差异性， 这些都增加了基因诊断的难度。在我国西北等多民族聚居区进行耳聋分子流行病学调查进而查明其主要突变位点发病情况可以和我们已经进行的全国其它地区的数据对比分析，了解人口的迁移、 不同人种通婚对于耳聋基因突变的影响，进一步深化对全国各地区各人种中不同基因突变引起耳聋的理解， 从而可以更好的指导临床实践。

    　　GJB2基因是目前研究最为广泛的基因，该基因的突变几乎覆盖整个编码区，目前已发现GJB2基因有111种突变方式，其中显性突变9种； 隐性突变92种， 未知突变10种［5］。 98％ GJB2基因有两种突变方式， 即纯合子或复合杂合子。35delG是欧美人群中隐性遗传性耳聋最常见的突变热点，但在东亚人群中发病率极低。235delC是东亚地区耳聋人群最常见的突变， 携带率约为15% ～ 25%［2, 6］。 本研究通过酶切法研究235delC在新疆乌鲁木齐聋哑学生中的携带率，发现新疆三个主要民族聋哑学生的235delC携带率比较无显著性差异，本文中维族和回族的聋哑学生例数偏少是造成GJB2突变检出率在三个民族聋哑学生中差异不大的可能原因，长期的共同生活、民族间通婚也是差异不大的另一个可能原因。和全国各个省耳聋分子流行病学研究的数据比较， 本研究显示， 在乌鲁木齐聋哑学生中GJB2突变的检出率处于较低的水平［2］， 但仍高于高加索人种。不同人群、不同地域间GJB2 235delC的突变携带率不同，这其中原因相当复杂， 可能是人种、 地域、环境因素的差异共同引起了这种不同。 东亚地区耳聋人群GJB2 235delC突变可能来自共同的祖先，不同的群体由于迁移、 婚配等原因造成代与代之间基因频率波动， 每一群体发展起各自的基因库，基因库可以反映本群体始祖的基因结构， 这种所谓的“始祖效应”（founder effect）可以解释中国不同地区GJB2 235delC检出率的差异。Yan等 [7] 推测235delC突变起源于贝加尔湖地区，大约有11500年的历史，随着人群的迁移蒙古人种和高加索人种的分离传到了中国、 蒙古、 日本等地。

    　　MtDNA 12SrRNA基因 A1555G突变可以导致SNHL，并且和氨基糖甙类药物的使用密切相关。A1555G位点突变是与耳聋有关的最常见mtRNA突变，一般报道阳性率为1 ～ 3% ［2, 8-10］。新疆三个主要民族聋哑学生群体中A1555G检出率比较无显著性差异。 Malik等  ［11］ 在印尼的苏拉威西岛75位非综合症性耳聋患者中， 检测到A1555G阳性患者4例， A1555G携带率达5.3%， 是一个比较高的阳性率。我们的研究中A1555G位点突变总阳性率9.28%， 其中汉族阳性率11.27%，这是在我们全国性调查中发现的最高阳性率。此地区mtDNA A1555G突变的高检出率的具体原因有待进一步　研究。

本研究发现新疆194例SNHL患者中11例（5.67%）携带GJB2基因235delC纯合突变； 11例（5.67%）携带GJB2基因235delC杂合突变。根据我们的全国性耳聋分子病因学研究的数据表明，多数GJB2基因235 delC杂合突变能够发现GJB2基因上的第二个突变， 携带GJB2基因235delC杂合突变也提示耳聋发病的遗传因素。同时调查结果显示在新疆SNHL患者mtRNA 12SrRNA基因 A1555G具有发病率较高的特点。新疆的研究结果表明仅GJB2 235delC和mtDNA A1555G检测就可为20.62% 的聋哑患者提供比较可靠的诊断信息，为耳聋患者的基因诊断提供了理论依据。

    　　志谢： 感谢新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市特殊教育学　校所有教职员工及学生在本课题研究中给予的大力支持和　　帮助。

【参考文献】  1　Steel K. Science, medicine, and the future: New interventions in hearing impairment. BMJ, 2000, 320(7235): 622-625.

2　戴朴, 刘新, 于飞，等. 18个省市聋校学生非综合征性聋病分子流行病学研究(Ⅰ)—GJB2 235delC和线粒体DNA 12SrRNA A1555G突变筛查报告. 中华耳科学杂志, 2006, 4(1): 1-5.

3　戴朴， 杨伟炎，韩东一，等. Prev-DAF试剂盒分析线粒体基因1555A-G突变. 中华耳科学杂志, 2004, 2(1): 37-41.

4　戴朴, 于飞, 康东洋，等. 线粒体DNA1555位点和GJB2基因及SLC26A4基因的诊断方法及临床应用. 中华耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2005, 40(10): 769-773.

5　Ballana E, Ventayol M, Rabionet R, Gasparini P, Estivill X. Connexins and deafness homepage [EB/OL][2006-03-22]. http://davinci. crg. es/deafness/.

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7　Yan D, Park HJ, Ouyang XM, et al. Evidence of a founder effect for the 235delC mutation of GJB2(connexin 26) in east Asians. Hum Genet, 2003, 114(1): 44-50.

8　Usami S, Abe S, Akita J, et al. Prevalence of mitochondrial gene mutations among hearing impaired patients. J Med Genet, 2000, 37(1): 38-40.

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11　Malik S, Sudoyo H, Sasmono T, et al. Nonsyndromic sensorineural deafness associated with the A1555G mutation in the mitochondrial small subunit ribosomal RNA in a Balinese family. J Hum Genet, 2003, 48(3): 119-124.