鼻息肉患者T淋巴细胞的活化状态及其细胞因子的分泌

作者：陈嵘，史剑波，曾山，马永忠，黄桂球    作者单位：（广东省中山市人民医院耳鼻咽喉科，广东中山 528403；中山大学第一附属医院耳鼻咽喉科医院，广东广州510080；暨南大学生命科学院组织移植与免疫中心，广东广州 510632）

【摘要】  目的 分析T淋巴细胞膜表面标志的表达及其细胞因子的分泌，了解人鼻息肉T淋巴细胞的活化状态及Th1/Th2反应的特点。方法 采用流式细胞术检测45例鼻息肉患者鼻息肉组织、外周血中T细胞膜表面标志CD3、CD69的表达和Th1 代表性细胞因子IFNγ、Th2代表性细胞因子IL4的分泌水平,并与正常人下鼻甲黏膜及外周血的相应指标进行比较。结果 (1)患者鼻息肉组织及外周血T细胞均表达CD69分子，在鼻息肉组织局部CD69分子的表达更高(Ｐ<0.01)。而在正常人下鼻甲黏膜中几乎未见CD3+CD69+细胞。(2)鼻息肉组织及患者外周血T细胞中均检测到IL4、IFNγ的表达，而在正常人下鼻甲黏膜中几乎未见CD3+IL4+和CD3+IFNγ+细胞。与正常人相比，患者外周血中IL4、IFNγ的含量均升高(Ｐ<0.01)；与同一患者外周血相比，鼻息肉组织中IL4的含量增高(Ｐ<0.01)而IFNγ的含量降低(Ｐ<0.01)。结论 鼻息肉组织中的T细胞高度表达CD69分子，处于免疫活化状态，产生Th1/Th2混合模式的细胞因子，与外周血相比Th细胞因子分泌优势发生改变，可能与鼻息肉“微环境”形成及黏膜免疫系统有关。

【关键词】  鼻息肉；T淋巴细胞；淋巴细胞膜表面标志；细胞因子；流式细胞术

Study on immunocompetence and cytokine secretion of T lymphocytes infiltrating nasal polyps

　　CHEN Rong,SHI Jianbo,ZENG Shan,MA Yongzhong，HUANG Guiqiu

　　(Department of Otorhinolaryngology of People's Hospital of Zhongshan City, Zhongshan 528403, China;The First Hospital of SenYatSen University of Medical Sciences,Guangzhou, 510080,China;Institute of Tissue Transplantation and Immunology of Jinan University, Guangzhou 510632, China)      　　Abstract: Objective   Study on immunocompetence and cytokine secretion of T lymphocytes infiltrating nasal polyps.Methods   Nasal polyps tissues and peripheral blood from 45 patients with nasal polyps and inferior turbinate mucosa and peripheral blood from normal people were collected for the experiment, respectively. Flow cytometry was adopted to detect the expression of T cell surface markers (CD3, CD69) and serum production of Th cytokines (IL4,IFNγ).(1)Activation marker CD69 expressed highly in T cells from the nasal polyps and peripheral blood of patients, especially higher in T cells from the nasal polyps (Ｐ<0.01). CD3+CD69+ T cells were rarely seen in the normal inferior turbinate mucosa and peripheral blood. (2)IL4 and IFNγ were detected in T cells from the nasal polyps and peripheral blood of the patients.CD3+IL4+ and CD3+IFNγ+ T cells were rarely detected in the normal inferior turbinate mucosa. Compared with in the normal people, the serum IL4 and IFNγ significantly increased in patients (P<0.01).  The IL4 level was higher but the IFNγ level was lower in the nasal polyps than those in the peripheral blood from the same patient (Ｐ<0.01).Conclusion   The T cells in nasal polyps express high CD69 and are activated, producing Th1/Th2 mixed cytokines with change of cytokine secretion predomination, probably owing to the formation of microenvironment of the nasal polyps and the mucosa immune system.         　　Key words: nasal polyps; T cells; surface markers; cytokines; flow cytometry       　　鼻息肉是鼻部的常见病，具体的发病机制仍未完全阐明，可能与鼻息肉组织异常的免疫状态及在此种状态下产生的多种细胞因子的协同作用有关。本文采用流式细胞术（flow cytometry, FCM）观察鼻息肉组织中T淋巴细胞浸润和其活化分子CD69的表达情况，并检测IL4、IFNγ两种细胞因子在细胞内的分泌情况，观察外周血与鼻息肉病变局部中两种细胞因子表达的改变及Th1/Th2反应的特点，借此探讨鼻息肉的可能发病机理。       　　1   资料和方法       　　1.1   临床资料

　　1.1.1   鼻息肉标本   选取2005年6月至2008年1月慢性鼻窦炎伴鼻息肉患者45例，男32例，女13例，中位年龄48.7岁（23～76岁），均为Ⅱ型1～3期［1］，不伴有过敏性鼻炎、支气管哮喘等其它典型病史。所有患者被证实手术前至少2个月内未使用过皮质类固醇激素等影响机体免疫功能的药物，未患过流感等上呼吸道感染。手术前采取同一患者的外周血作为对照。

　　1.1.2   正常人外周血、健康鼻黏膜标本   选取接受健康体检的志愿者外周血标本10例，男5例，女5例，中位年龄25.4岁（18～36岁）；选取意外死亡的非鼻病志愿者的下鼻甲黏膜7例，男5人，女2人，中位年龄30.1岁（22～41岁）。       　　1.2   检测方法

　　1.2.1   标本收集   鼻内镜手术中取得鼻息肉、鼻黏膜标本，浸入无菌磷酸盐缓冲液（PBS，4 ℃, pH7.4）中保存；注射器抽取外周血2 mL，加入含50U/ mL肝素的无菌试管中，轻轻摇匀。以上标本4 ℃冰箱暂存（不超过6h）。

　　1.2.2   鼻息肉、鼻黏膜组织的处理

　　1.2.2.1   单个核细胞分离   无菌条件下将鼻息肉或鼻黏膜标本剪碎成糊状，加入0.25％胰蛋白酶，震荡后室温静置15～20min，200目筛网过滤去除未消化的组织。将滤过液移入离心管，1500r/min离心5min，弃上清，分离获得单个核细胞。混悬于RPMI1640完全培养液中，调节细胞浓度至1×106cells/mL。

　　1.2.2.2   细胞膜表面标志检测   （1）取1mL细胞悬液1500 r/min离心5 min，弃上清，先加入界定T淋巴细胞的抗人CD3单克隆抗体，再加入抗人CD69单克隆抗体（每份抗体量为1μg/106细胞），混匀后室温避光作用20 min。加入红细胞裂解液2 mL，室温下裂解10 min。用4％多聚甲醛PBS 400μL悬浮、固定细胞，每次均用染色缓冲液洗涤、1500 r/min离心5 min、弃上清。24h内用流式细胞仪分析。(2）另取细胞悬液进行体外活化：将多克隆刺激剂佛波醇酯（PDB，终浓度2×10-7mol/L）＋离子霉素（Ionomycin，终浓度10-6mol/L）加入24孔板，再加入细胞悬液，混匀，使反应体积为1 mL。置于37 ℃、5％CO2条件下培养5 h，收集细胞，进行细胞膜表面标志染色及流式细胞仪分析（同前）。

　　1.2.2.3   细胞内Th细胞因子检测   （1）在24孔板中加入蛋白转运抑制剂Brefeldin A(终质量浓度10mg/L)以抑制细胞因子分泌出胞外，再加入细胞悬液，混匀，使反应体积为1 mL，置于37 ℃，5％CO2条件下培养5h，5h后收集细胞。（2）双色免疫荧光标记：取收集的细胞悬液1 mL，1500 r/min离心5 min，弃上清，加入抗人CD3单克隆抗体（每份抗体量为1 μg/106cells），室温避光下作用20 min。加入红细胞裂解液2 mL，室温下裂解10 min；用4％多聚甲醛PBS 500μL固定细胞；皂素液破膜10 min，每次均用染色缓冲液洗涤，1500 r/min离心5 min，弃上清。加入单克隆抗体antihuman IFNγ或antihuman IL4（每份抗体量为1μg/106cells），室温避光下作用30 min，洗涤缓冲液（含0.1％皂素）洗涤，1500 r/min离心5 min，弃上清，最后用2％多聚甲醛PBS 400μL悬浮、固定细胞。24 h内进行流式细胞仪计数。   　　1.2.3   患者、正常人外周血的处理   将一部分肝素抗凝后的外周血与RMPI1640完全培养液1:2稀释，另一部分不稀释。稀释后的外周血用于全血培养、活化。细胞膜表面标志及细胞内Th细胞因子检测操作步骤基本同前述单个核细胞悬液。       　　1.3   统计学处理       　　全部数据经FACStarPlus流式细胞仪及LYSYS Ⅱ软件获取和分析。结果用统计软件SPSS 8.0 for Windows 程序处理，数据以均数±标准差表示［(±ｓ)％］，采用t检验。       　　2   结果       　　45例鼻息肉组织标本经过单个核细胞分离处理后进行流式细胞术检测，CD3+细胞占检测细胞总量的(39.65±2.08)％；而在健康下鼻甲黏膜中未见CD3+细胞。在健康人下鼻甲黏膜中，未检测到T淋巴细胞活化的表面标志CD69，而鼻息肉组织中的T淋巴细胞在用多克隆刺激剂PDB作用之前即高表达CD69分子；PDB作用5h后CD69分子的表达进一步增高（P<0.01）。与鼻息肉组织相比，患者外周血T淋巴细胞CD69分子的表达在未刺激之前较低，在刺激后CD69分子表达增加（P<0.01）。与患者相比，健康人外周血T淋巴细胞在刺激前CD69分子的表达极低，但在刺激后几乎全部活化（P<0.01）（见表1）。与正常人外周血相比，患者外周血T淋巴细胞IL4、IFNγ的表达均增多（P<0.01），与患者外周血相比，鼻息肉组织T淋巴细胞IL4的表达增多（P<0.01），而IFNγ的表达减少（P<0.01）（见表2）。       　　3   讨论       　　T淋巴细胞在整个免疫系统中起中心作用，它活化后通过其分泌的细胞因子对其他免疫细胞在活化、增殖、分化和效应者作用等方面发挥上调或下调的关键性作用。细胞因子分为Th1和Th2两大类，分别来源于Th1和Th2两类T细胞，大量实验证实，Thl和Th2细胞在免疫应答的平衡中起关键性作用［2］，两者的平衡状态与免疫相关性疾病的转归密切相关。在正常人鼻黏膜中，病理因素可能使Th细胞发生极化，引起细胞因子分泌的紊乱，从而可能导致鼻息肉的发生。       　　表1   鼻息肉组、患者外周血组和健康人外周血组PDB刺激前、后T淋巴细胞CD69表达的比较（略）

　　a与b比较，Ｐ<0.01;  d与e比较，Ｐ<0.01;  b与c比较，Ｐ<0.01;  e与f比较，Ｐ<0.01。       　　表2   鼻息肉组、患者外周血组和健康人外周血组T淋巴细胞IL4、IFNγ的表达（略）

　　a与b比较，Ｐ<0.01;  d与e比较，Ｐ<0.01;  b与c比较，Ｐ<0.01;  e与f比较，Ｐ<0.01。

　　在我们所选择的研究指标中，CD3分布于成熟的T淋巴细胞表面，而CD69T淋巴细胞活化后所表达的表面抗原中表达最早、研究最多的一个［34］，在双色荧光标记的CD3和CD69单克隆抗体的诱导下，活化的T淋巴细胞在流式细胞仪下表现为双色荧光，可以用来检测、界定活化的T淋巴细胞。IL4、IFNγ的相互作用是维持Th1与Th2细胞平衡的关键，在某种意义上Th1和Th2细胞可指分别产生IFNγ和IL4的细胞［5］，通过检测这两种细胞因子可以反映两种细胞的状态与功能。                                           　　国内外学者已经作了大量的相关研究。SanchezSegura等［6］利用FCM检测到了鼻息肉组织T淋巴细胞CD69分子的高度表达。Bernstein等［7］曾用流式细胞仪测定鼻息肉组织与外周血的T细胞亚群，发现鼻息肉组织与外周血T细胞亚群存在差别，认为鼻息肉组织的淋巴细胞既来自外周血淋巴细胞的迁移也来自局部的黏膜免疫系统。Stoop等［8］研究指出鼻息肉的形成与鼻黏膜特定部位的慢性炎症和黏膜的T细胞亚群分布失衡（T celldependent disturbances）有关。Homilies等［9］认为Th细胞激活后释放一系列细胞因子导致鼻息肉的形成，说明在鼻息肉组织中免疫反应性呈活化和扩大状态。Min等［10］进行鼻息肉基因研究发现：与正常下鼻甲黏膜相比，鼻息肉组织中IL4、IFNγ的mRNA均高表达且IFNγ的密度高于IL4。Lee等［11］的研究也得到相似的结论并指出细胞因子而不是变态反应在鼻息肉的形成过程中起重要作用。Dellacono等［12］用ELISA法测得鼻息肉中IFNγ的平均水平高于正常鼻甲黏膜并推断鼻息肉中IFNγ的水平高低与临床症状的严重程度有关，可能能够作为鼻息肉患者预后的一项临床指标和治疗针对性发展的方向。       　　本文发现鼻息肉组织中有大量T淋巴细胞浸润，且在PDB刺激前的初始状态时即有较高的CD69的表达，T淋巴细胞的活化比率平均在35％以上。而在正常下鼻甲黏膜中未见CD69+细胞，提示其基本上处于免疫静止状态。PDB刺激前，鼻息肉患者外周血T淋巴细胞CD69的表达与健康人相比升高（P<0.01），而鼻息肉组织T淋巴细胞CD69的表达与同组患者外周血相比又进一步显著升高（P<0.01），提示全身血液循环中的T淋巴细胞可能因为鼻息肉局部的相关因素导致CD69的表达显著增高，在病变局部的T淋巴细胞处于更高的免疫活化状态。患者及健康人外周血在PDB刺激后CD69分子表达大幅度增加（P<0.01），说明外周血中T淋巴细胞仍具有相当高的活化潜能；鼻息肉组织在刺激后CD69分子表达也增加（P<0.01），但可能由于其本身即处于高活化状态，所以活化率的提高幅度远不如外周血。同时，本文在正常下鼻甲黏膜中未检测到CD3+IL4+细胞和CD3+IFNγ+细胞，说明在正常组织中T淋巴细胞浸润极少且处于非活化的静止状态，缺乏分泌细胞因子的能力。在鼻息肉组织T淋巴细胞中同时检测到IL4、IFNγ的表达，表明鼻息肉微环境中分泌Th1/Th2混合型的细胞因子且后者的表达相对较多。正常人外周血T淋巴细胞中，IL4、IFNγ的表达极微，说明只有在疾病因素下激活的细胞亚群才能表达细胞因子，静止的T淋巴细胞不能分泌细胞因子；鼻息肉患者外周血与正常人相比，IL4、IFNγ的表达均升高，表明T淋巴细胞受刺激而活化分泌细胞因子。与患者外周血相比，鼻息肉组织T淋巴细胞IL4的表达增多（P<0.01），这与国外学者的研究相同［7,13］，而IFNγ的表达减少（P<0.01），提示鼻息肉患者外周循环中的Th细胞因子分泌优势在病变局部发生了变化，Th1/Th2反应向Th2方向极化。       　　基于本文结果，我们推测，病变局部因素可能会导致鼻息肉T淋巴细胞异常活化，从而引起鼻黏膜免疫状态的改变、免疫反应性的增强，而活化后的T淋巴细胞所分泌的IL4、 IFNγ的表达在鼻息肉局部的变化可能导致了鼻息肉组织Th极化发生改变，从而促进鼻息肉的形成。但鼻息肉病变局部异常活化T淋巴细胞及其所分泌的两种细胞因子在鼻息肉发生过程中作用的确切机制仍有待进一步研究。

【参考文献】  　　［1］ 中华医学会耳鼻咽喉科学分会,中华耳鼻咽喉科杂志编辑委员会.慢性鼻窦炎鼻息肉临床分型分期及内窥镜鼻窦手术疗效评定标准［J］.中华耳鼻咽喉科杂志,1998,33(3):134.

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