剪切力对耳蜗微血管内皮细胞细胞骨架的影响

作者：袁伟　张学渊　魏运军　李琪　姜振　东钟诚    作者单位：重庆第三军医大学第一附属医院耳鼻咽喉科（重庆　400038）

【摘要】  目的　观察不同剪切力对体外培养的豚鼠耳蜗微血管内皮细胞形态学及细胞骨架的影响。方法　用自制的流体力学装置在不同时相点、 以不同剪切力对豚鼠耳蜗微血管内皮细胞行力学作用，获得形态学图象，同时对其细胞骨架在激光扫描共聚焦显微镜下行F-actin荧光染色测定分析。结果　不同大小的剪切力作用会导致细胞形态发生变化； 细胞形态变化后会出现应力纤维改变， 应力纤维的变化早于形态学改变，这种改变随剪切的时间、 力量变化而变化。 结论　豚鼠耳蜗微血管内皮细胞在受到剪切力作用后之所以会产生形态学改变， 可能与细胞骨架变化有关。

【关键词】  耳蜗；　内皮，血管；　血液动力学；　细胞骨架；　激光扫描共聚焦显微术

     Effects of shear stress on the cytoskeleton in cochlear microvascular

    endothelial cells

    YUAN wei,  ZHANG Xue-yuan,  WEI Yun-jun,  LI Qi,  JIANG Zhen,  DONG Zhong-cheng

    Depadtment of Otorhinolaryngology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, china

    　　【Abstract】 Objective　To investigate the effects of different shear stresses on the morphological changes and cytoskeleton in cochlear microvascular endothelial cells cultured in vitro. Methods　The morphological changes of cochlear microvascular endothelial monolayer cells were caused by exposure to hydrodynamic shear stress and fluorescently-labelled F-actin of cochlear microvascular endothelial monolayer cells was observed and detected by laser scanning confocal microscopy. Results　Different shear stresses led to morphological changes. Stress fibers formed when the morphological changes occurred and the formation took place prior to the morphological changes and was shown to be shear stress- and time-dependent. Conclusion　Ｍorphological changes were observed in cultured cochear microvascular endothelial cells after exposure to shear stress. The mechanism of morphological changes due to shear stress effect may possibly be related to cellular skeleton.

    　　【Key words】　Ｃochlea;　Endothelium, vascular;　Hemodynamics;　Ｃytoskeleton;　Laser scanning confocal microscopy

    　　血迷路屏障是保持内耳迷路液成分相对稳定、维持内耳微环境的重要生理屏障。血迷路屏障的关键是内耳毛细血管通透性，影响其通透性的基础是毛细血管的连续型内皮细胞［1］。作为血流与管壁的界面，内皮细胞时刻接受着血流剪切力的冲击， 细胞的功能与所处力学环境密切相关。研究发现静态培养的内皮细胞在剪切力的刺激下可发生形态学变 化［2］， 但其形态学改变的机理以及其与剪切力变化的关系如何尚未见报道，我们对此进行了相关研究。

    1　材料和方法

    1.1　实验动物　选用健康封闭群豚鼠10只（第三军医大学动物所），　耳廓反射灵敏，无中耳感染，　雌雄不拘，体重300 g左右。随机数字表法分别选入２组，每组5只。

    1.2　主要实验试剂　Ⅰ型胶原酶（Sigma，美国），　兔抗人Ⅷ因子相关抗原（Ⅷ-R Ag）试剂盒（北京中山生物技术有限公司），鬼笔环肽荧光标记试剂（Oregon Green 488 phalloidin， Molecular  Ｐrobes，美国）。

    1.3　实验设备　灌流系统由驱动恒流泵（HL4上海沪西仪器厂）、 平行平板流动腔、 储液器及若干导管组成。实验时， 贮液槽、 平行平板流动腔及部分导管置于恒温孵箱内（Forma 3111, 美国）， 光学照相系统采用在平行平板流动腔橡胶垫片中央开窗， 在倒置相差显微镜下通过透明有机玻璃直接观察内皮细胞形态变化并记录［1］，激光扫描共聚焦显微镜（Leica  Tcs  NT，德国）， Tiger图像分析仪（第三军医大学细胞生物学教研室提供）。

  1.4　实验方法

    1.4.1　参照本实验室方法进行豚鼠耳蜗血管纹微血管内皮细胞的分离、 培养、 纯化和鉴定［1］。 豚鼠耳蜗血管纹组织段经0.5%Ⅰ型胶原酶消化后，整体形成“铺路石”样［２］。 培养细胞经免疫组化（SP法）鉴定， 对 Ⅷ 因子抗原反应阳性，证实为内皮细胞。分别选取0 h、 0.5 h、 1 h、 2 h、 4 h、 8 h、 16 h、 24 h等8个时相点用倒置相差显微镜对受到不同剪切力作用后的耳蜗微血管内皮细胞进行形态学观察，以初始0 h未接受剪切力作用的内皮细胞作为对照。

    1.4.2　根据我们的实验结果［2］， 设计第一组实验动物接受0.0883 Pa剪切力，第二组接受0.1184 Pa剪切力，并于0.5 h ～ 24 h各时段在激光扫描共聚焦显微镜下对两组的Oregon Green 488 phalloidin 标记的F-actin（F-肌动蛋白）的荧光值进行测定。F-actin荧光染色步骤：贮存液浓度200 IU/ml, 工作液（1：10磷酸缓冲液稀释， 100 ?滋l/样本)， 避光常温染色30分钟， 磷酸缓冲液漂洗3 × 5分钟， 甘油封片。激光扫描共聚焦显微镜荧光检查，激发光波长为       488 nm， 发射光波长为520 nm。各测定值（每组样本数据各时相点的平均值）与该组0 h的荧光平均值比较进行统计学分析。

    1.4.3　采用SPSS 13.0软件随机区组方差分析方法对各组数据进行统计分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

    2　结　果

    　　剪切力作用后的耳蜗微血管内皮细胞细胞骨架F-actin激光共聚焦荧光检测结果：未接受剪切力作用的内皮细胞的细胞骨架微丝F-actin排列无序，微丝较细，未形成应力纤维（图1）。当剪切力为0.1184 Pa、 对内皮细胞的剪切作用8h时， 虽然细胞形态未见明显变化，但细胞骨架中的微丝（F-actin）排列已有变化，含量亦逐渐增加， 出现应力纤维， 且应力纤维的方向性较强，与细胞长轴一致（图2）， 主要出现在细胞中央。作用8小时后， 出现排列有序的应力纤维。随着作用时间延长， F-actin含量及排列方向性更加有序，细胞中央微丝变得粗大有力（图3）， F-actin测量结果与未受剪切力作用时比较， P < 0.05， 差异有显著性（表1）。

    3　讨　论

    　　血流剪切力通过对管壁作用使内皮细胞形态学发生变化，可使细胞与细胞间空隙、细胞内结构改变， 最终导致血管通透性的变化［2］。作为血迷路屏障关键的内耳毛细血管连续型内皮细胞，其与剪切力的关系我们已进行了报道。微血管内皮细胞对于剪切力发生的形态学变化并不是一个被动过程，而是一个主动的过程。这个过程主要依赖于细胞骨架的重建。细胞骨架成份包括微管、 微丝、 中间丝3种结构， 而对应剪切力改变的主要结构是微丝，主要成份为F-actin。在静态培养内皮细胞中微丝短细排列无序， 而经过剪切作用后的细胞出现应力纤维， 微丝呈现顺流动方向的一致性，即对力学环境的适应性。我们对培养的单层细胞进行了长达24小时的力学作用，并于0.5 h ～ 24 h各时段进行Q（截面或投影轮廓的长宽比，是个体测量参数的形状因子）值图像分析测量，每一测量平均值与0 h比较进行统计学分析［2］。结果发现，当剪切力为0.0883 Pa时，对单层培养的内皮细胞剪切作用持续24小时，倒置相差显微镜下观察单个细胞的形态未发生明显变化，统计分析数据Q各时段间P > 0.05， 各组之间差异无统计学意义；当剪切力增大为0.1184 Pa时， 镜下观察发现剪切力作用8h后细胞形态开始出现顺应性变化，单个细胞由以前的椭圆形变为顺流体方向的长梭形， 24小时后细胞变化更加明显。经统计分析测得Q各时段数据P < 0.05，差异具有统计学意义。之所以发生形态学变化是与细胞骨架中的微丝变化密切相关。Ookawa等 ［3］ 发现微丝的重组出现在形态变化之前，说明剪切力引起内皮细胞形态变化是微丝重组的结果。本实验研究同样发现，当剪切力为0.0883 Pa时，剪切力量较小，作用24 h后形态和F-actin含量均未发生明显变化；当剪切力为0.1184 Pa时，作用力增强， 0.5 h后细胞形态未发生变化， 但细胞内F-actin发生变化， 微丝荧光含量测定增加， 微丝排列变的有序，出现应力纤维， 8h后细胞形态学发生顺流体方向变化，这时经荧光分析，微丝荧光含量逐渐增大，微丝变得粗大、有力，可以推测细胞骨架变化是形态学改变的基础。Levesque等 ［4］ 发现用细胞松驰素作用于静态培养细胞F-actin，内皮细胞在剪切力作用下伸长不明显，作用于已受到剪切力作用后伸长的细胞，则内皮细胞变圆，再次证实了剪切力是影响内皮细胞应力纤维表达的主要因素。正常情况下， 微丝主要分布于细胞周边和核周围，受到剪切力作用后， 微丝逐渐向中央集中，形成中央粗大应力纤维。关于微丝中F-actin的含量如何增加问题， Morita等［5］研究发现， F-actin与G-actin（Ｇ－肌动蛋白）可发生转换，也就是说，当剪切力增大时， G-actin向F-actin发生转换，导致F-actin含量增多，并没有肌动蛋白总量的增加，而是F/G比率提高的结果。至于剪切力如何将力学信号传递入细胞内部， 目前有许多学说。对耳蜗微血管内皮细胞而言，导致形态学改变的力学信号如何传递、大血管及微血管的改变是否相同、 不同部位改变的分子生物学基础是否一致等都有待进一步 研究。

【参考文献】1　张学渊， 魏运军.耳蜗微血管内皮细胞通透性体外模型的研究. 中华耳鼻咽喉科杂志， 2001, 36（6）： 409-411.

2　袁伟， 张学渊， 魏运军，等. 剪切力对豚鼠耳蜗微血管内皮细 胞形态学的影响. 中华耳鼻咽喉头颈外科杂志， 2007, 42(2): 135-137.

3　Ookawa K, Sato M, Ohshima N. Time course changes in cytoskeletal structures of cultured endothelial cells exposed to shear stress. Front Med Biol Eng, 1993, 5(2): 121-125.

4　Levesque MJ, Nerem RM. The study of rheological effects on vascular endothelial cells in culture. Biorheology, 1989, 26(2): 345-357.

5　Morita T, Kurihara K, Maemura K, et al. Disruption of cytoskeletal structures mediates shear stress-induced endothelin-1 gene expression in cultured porcine aortic endothelial cells. J Clin Invest, 1993, 92(2): 1706-1712