表没食子儿茶素没食子酸酯抑制人鼻咽癌细胞的生长机制

作者：罗国庆   

作者单位：广东医学院附属医院耳鼻喉科，广东 湛江 524001

【摘要】  目的： 探讨表没食子儿茶素没食子酸酯［(-)epigallocatechin3 gallate, EGCG］抑制人鼻咽癌CNE2Z细胞系生长增殖的机制,寻找鼻咽癌治疗的新靶点. 方法：用EGCG处理人鼻咽癌CNE2Z细胞, 应用MTT试验观察不同浓度的EGCG对癌细胞生长增殖的影响；流式细胞仪检测用药前后细胞周期的变化；用逆转录聚合酶链反应分析ras相关区域家族1A（RASSF1A）mRNA表达情况. 结果： 从CNE2Z细胞生长曲线判定EGCG对细胞生长均有抑制作用；流式细胞分析结果显示,G0/G1期细胞增加,S期细胞减少；经EGCG处理后,细胞中均有RASSF1AmRNA表达, 且表达随药物浓度增高而增强. 结论： EGCG对体外培养的鼻咽癌细胞生长增殖的抑制作用,可能是由于其能使因甲基化而失活的RASSF1A基因再转录,诱导该基因重新表达的结果.

【关键词】  没食子儿茶素没食子酸酯 RASSF1A基因 CNE2Z细胞系 甲基化

　0引言

　　鼻咽癌是耳鼻喉科常见的恶性肿瘤之一,尤其在我国的南部地区有很高的发病率. 鼻咽癌的治疗方法主要是放射治疗,目前的化疗药物疗效均不十分显著. 表没食子儿茶素没食子酸酯［(-)epigallocatechin3 gallate, EGCG］能使因甲基化而失活的抑癌基因重新表达，从而抑制肿瘤的生长［1］. 我们用EGCG处理鼻咽癌CNE2Z细胞,观察了其对CNE2Z细胞生长增殖的影响及ras相关区域家族1A(RASSF1A)表达的变化,以寻找治疗鼻咽癌的有效药物.

　　1材料和方法

　　1.1材料人低分化鼻咽癌细胞系（CNE2Z）由广东医学院分子生物学与生物化学教研室惠赠. RPMI 1640 培养基(美国Gibco 公司)，碘化丙啶(PI)购于美国Sigma 公司. EGCG购于美国Sigma公司. 各PCR引物由上海生物工程公司合成. RTPCR试剂盒为德国QIAGEN公司产品，流式细胞仪为EpicsX2型.

　　1.2方法

　　1.2.1细胞培养及药物处理CNE2Z培养于含有100 mL/L灭活的小牛血清、10万U/L 青霉素和100 mg/L 链霉素的RPMI1640 完全培养基中，37℃，50 mL/L CO2 饱和湿度培养箱孵育，取对数生长期细胞实验. 按每孔3000个细胞/孔接种于96孔培养板，细胞接种16 h后分别用不同浓度EGCG（0，50，100，200 mg/L）处理，每5孔为一药物浓度组，共接种4板，每日取1板，加入5 g/L MTT液20 μL, 37℃孵育4 h后弃去上清液,每孔加入DMSO 150 μL,震荡10 min,使结晶物充分溶解, 在570 nm波长酶联免疫检测仪上测定各孔A值,求其平均数,绘制增值曲线.

　　1.2.2流式细胞术检测细胞周期同样方法接种处理CNE2Z细胞，48 h后胰酶消化，收集细胞，700 mL/L乙醇固定过夜，离心清洗后加入PI染液在流式细胞仪内检测各时相细胞比例.

　　1.2.3半定量RTPCRTrizol法提取各组细胞的总RNA(操作步骤祥见说明书). 以βactin为内参照. βactin引物序列：上游引物5′GTGCGTGACATTAAGGAG3′，下游引物 5′CTAAGTCATAGTCCGCCT3′，PCR产物大小517 bp;RASSF1A引物序列: 5′GCCCTCCAGCAAGAAG3′，5′TGAAGGCGTCCCAGTT3′, PCR产物大小362 bp.反应条件如下：50℃反转录30 min,95℃ 15 min,94℃变性1 min,54℃退火45 s,72℃延伸1 min,进行30个循环,72℃扩展10 min.

　　统计学处理：实验数据用x±s表示. 采用SPSS16.0统计软件，方差齐时各组间两两比较采用LDS 检验进行，方差不齐时各组间两两比较采用Tamhanes T2检验进行，P<0.05 表示差异有显著性意义. 所有实验至少重复3次.

　　2结果

　　2.1EGCG对细胞增值的影响经0，50，100，200 mg/L的EGCG分别处理后,CNE2Z细胞生长增殖曲线示:各种浓度的EGCG处理组与对照组(无药组)相比,肿瘤细胞增殖均被抑制,且浓度越高,抑制越明显（图1）.  

图1不同浓度EGCG处理CNE2Z细胞的增殖曲线（略）

　　2.2EGCG对CNE细胞周期的影响分别用不同浓度的EGCG（0，50，100，200 mg/L）作用CNE2Z 细胞48 h，然后收集各组细胞以流式细胞仪检测DNA 的含量. 结果表明：EGCG可以使其细胞周期G0/G1 期比例增加（P<0.05），S期比例降低（P<0.05），说明EGCG作用CNE2Z细胞48 h，可使其细胞周期阻滞于G0/G1 期（表1）.

　　表1EGCG作用48h后CNE2Z细胞周期分布（略）

　　aP<0.05 vs 对照组.

　　2.3EGCG对CNE2Z细胞系中ras相关区域家族1A基因（RASSF1A）表达的影响RTPCR产物琼脂糖凝胶电泳显示:未经药物处理的细胞中无RASSF1AmRNA表达,而经Zebulairne处理的细胞中出现RASSSF1A的表达,且表达随浓度增高而增强（图2）.

　　M：marker； 1~4：0，50，100，200 mg/L EGCG.

　　图2ras相关区域家族1A基因mRNA表达水平变化（略）

　　3讨论

　　DNA甲基化是真核细胞基因组重要的修饰方式之一，目前认为是一种新的基因调控机制，称为表基因调节，即基因序列不发生变化而基因表达受影响. 研究发现，在多种肿瘤组织中存在多个抑癌基因启动子区甲基化的现象［2］. 用甲基转移酶抑制剂EGCG处理有抑癌基因启动子区甲基化的细胞时发现，那些因启动子区甲基化而失活的抑癌基因被重新激活，且肿瘤细胞的生长增殖受抑制［3］.

　　EGCG是绿茶茶多酚的一种主要成分，具有多种生理活性和药理效应. EGCG在肿瘤的防治中有重要的作用，其抑癌机制包括：抗肿瘤血管形成、抑制端粒酶活性、引起细胞周期阻滞、诱导凋亡、抑制癌基因的表达及调节致癌物的代谢、调节有关致癌酶的活性等方面［4］. 近年来发现EGCG具有去甲基化抑瘤作用，在血液系统恶性肿瘤，肺癌等肿瘤均表现出较强的抑制作用［5-6］. 考虑可能的作用方式如下：细胞在DNA复制过程中，EGCG与甲基转移酶共价结合，形成稳定的复合物，消耗了细胞内的甲基转移酶，使甲基不能转移至胞嘧啶上. 进而使甲基化的碱基去甲基化. 本研究结果显示：经CNE2Z细胞被EGCG处理后G0/G1期细胞明显增加，而S期细胞显著减少. G0/G1期是细胞周期中重要的调节点,能明显抑制细胞周期的正常运行. 这可能是EGCG重新激活了某些细胞周期调控基因，恢复了对细胞增殖的调控. 从各组CNE2Z细胞的MTT结果可知，各种浓度的EGCG对CNE2Z细胞均有抑制作用，随着浓度的增加，抑制逐渐增强.

　　RASSF1A（ras相关区域家族1A）是2000年从3号染色体短臂上克隆出来新型肿瘤抑制基因，可通过不同的机制抑制肿瘤细胞的增殖，促进细胞凋亡. 学者们认为RASSF1A发生高度基因外失活，CpG岛启动子高度甲基化失是该基因失活的重要机制［7］. 在NPC中，RASSF1A基因的过甲基化水平大约为66%～84%［8］. RTPCR结果显示：随着EGCG浓度增加，RASSF1A的表达越来越高. 结果说明，在CNE2Z细胞中，EGCG可能是因甲基化而失活的RASSF1A基因去甲基化，进而重新激活. 当然得到确定的结果还需要完成甲基化特异性PCR和蛋白表达方面的实验，这也是我们下一步试验的重点.

　　综合本研究结果说明,EGCG对体外培养的鼻咽癌细胞生长的抑制作用,可能是其使因甲基化而失活的RASSF1A基因重新激活的结果. EGCG能使因甲基化而失活的抑癌基因重新激活,进而抑制肿瘤细胞的生长和增殖,为我们对肿瘤治疗的研究提供了新的思路. 绿茶是国人所喜爱的传统保健饮料之一, EGCG作为绿茶茶多酚的一种,来源广泛. 深入研究其对鼻咽癌的抗肿瘤机制和药理效应,对开发新的抗肿瘤药物有重要意义.

【参考文献】  　　［1］ 陈科, 罗招阳. EGCG的特性及抗肿瘤作用［J］. 美国中华临床医学杂志, 2006, 8(2): 238-239.

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［3］ Kong WJ,Zhang S,Guo C,et al.Methylationassociated silencing of deathassociated protein kinase gene in laryngeal sqnamous cell cancer［J］.Laryngoscope,2005, 115(8):1395-1401.

　　［4］ Baerjee S, Manna S, Mukherjee S, et al．Black tea polyphenols restrict benzopyreneinduced mouse lung cancer progression through inhibition of Cox2 and induction of caspase3 expression ［ J ］．Asian Pac J Cancer Prev，2006, 7(4)：661-666.

　　［5］ 邵箐，陈智超，李秋柏，等. EGCG对多发性骨髓瘤细胞KM3促血管新生作用的抑制效应及机制初探［J］. 中国实验血液学杂志, 2007, 15(5): 973-977.

　　［6］ 孙辑凯，黄立军，常东胜. EGCG抑制肺癌细胞增殖及其机制的研究［J］. 第四军医大学学报, 2007, 28(16): 1471-1473.

　　［7］ Dammann R, Schagdarsurengin U, Strunnikova M, et al. Epigenetic inactivation of the Rasassociation domain family 1(RASSF1A) gene and its function in human carcinogenesis［J］. Histol Histopathol, 2003,18(2):665-667.

　　［8］ Kwong J, Lo KW, To KF,et al.Promoter hypermethylation of multiple genes in nasopharyngeal carcinoma［J］.Clin Cancer Res, 2002, 8(1):131-137.