靶向克隆法构建pET15b-VP3原核表达载体

人类文明史就是一部人类与疾病的抗争史,药物在人类战胜疾病的斗争中发挥着重要和不可替代的作用,药物起先主要来源于对动植物及微生物中药物活性成份的分离和纯化。后来,随着科技的发展,人们逐渐采用化学合成的方法制各药物。分子生物学是上个世纪末建立和发展起来的新兴学科,应用基因工程手段制备药物已成为现在以及将来人类的一个重要研究方向。VP3基因来源于鸡贫血病毒(CAV),能够特异性诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞没有影响,作为一种潜在的抗肿瘤基因,具有重要的研究价值[1-3]。本文利用基因工程手段成功构建了能够表达VP3蛋白的原核表达载体,为VP3蛋白的临床应用奠定了基础。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1主要试剂PGEX6R1/TAT VP3质粒由昆明医学院王剑松教授惠赠,线性pET15b,DH5a由十堰市人民医院临床医学研究所提供。限制性内切酶Xho I、BamH I购自New England Bl。labs公司,AdvaltageR2Polymerase Mix购自TAKARA BIOTECHNOLOGY(DALIAN)公司,dNTP自美国Promega公司,DNA Fragment Quick Puhcation/RecoverKit购自北京鼎国生物技术公司,200bp DNA Ladder购自北京赛百盛基因技术有限公司,靶向克隆酶试剂盒(P Recco PCR Cloong Kit)购自美国Loopile公司。

1.1.2主要仪器PCR仪(Biometra,德国),凝胶图像分析系仪(Touching 995 gel document stem,上海),投射式紫外分析仪(EF-90A,上海),超速真空冷冻离心机(日本HITACHI公司),超速低温离心机(德国Hcraeus公司)。

1.2方法

1.2.1引物设计与合成 根据GeneBank中鸡贫血病毒CAV中的VP3cDNA序列,设计5端分别加有酶切位点Xllo I和BamH I的PCR上下游引物,上游引物:CAGCCATATGCTCGAGATG AACGCTCTCCAAGAA3',下游引物:GTTAGCAGCCGGATCCTTACAGTCTTATAC GCCT3'。划线部分分别为Xho I、BamH I酶切位点,斜体部分与线性化载体pET15b切口两端序列同源以便靶向同源重组,引物由上海生工公司合成。

1.2.2 PCR获取目的基因以PGEX-6P-1/TAT-VP3质粒为模板,以上述上下游引物进行PCR扩增。PCR反应体系:去离子水56uL,10×PCRbuffer10uL,DNA聚合酶Mix2uL,dNTP 10uL,上游引物10uL,下游引物10uL,PGEⅪ6R 1/TAT VP32uI,分装于2只EP管上机。扩增条件:起始变性95℃1min,然后执行如下反应条件:95℃3os,68℃3min,35个循环,最后68℃延伸3min。

1.2.3原核表达质粒pET15⒍VP3的构建:低熔点琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收纯化VP3cDNA片段,应用靶向克隆酶,将纯化后的VP3cDNA与末端序列相同的线性pET15b进行同源重组,反应体系dO×Reaction Buffer2uI',Linearized pET15b5 uL PCR-amphfiied DNA3uL,LP Recc。Enzyme(200U/uL)0·5uL,去离子水9,5uL,共20uL,25℃放置30min,取出5uL反应液转化感受态DH5a,并涂布到含氨苄青霉素(10O mg/L)的琼脂TB培养基上生长16h,任意挑选钅个白色单菌落的一部分做菌落PCR鉴定并作标记,剩余部分菌落接种于含有氨苄青霉素(100mg/L)TB培养基中培养⒛h后少量提取并纯化质粒,通过Xho I和BamH I双酶切鉴定,然后将重组质粒送往上海生工公司武汉分部测序鉴定。

2结果

2,1 VP3基因的PCR扩增以PGE61/TAVP3质粒为模板,经VP3基因的上下游引物行PCR扩增后,行1,2%琼脂糖凝胶电泳可见一条366bp特异扩增条带,与我们需要的目的基因大小相吻合,见图1。

2.2重组pET15P3原核表达载体构建回收并纯化上述PCR产物,在靶向克隆酶的作用下与线性pET15b在室温下进行30min的靶向克隆反应,靶向克隆酶能够使末端序列相同的双链DNA(14.18)bp进行同源重组,从而达到克隆基因的目的,所获得的阳性克隆命名为pET151-VP3。

2.3重组的pET15b-VP3原核表达载体鉴定结果

2.3.1菌落PCR鉴定重组的pET15b VP3阳性克隆经特异引物PCR扩增获得长约366bp的片段,与理论值一致,表明VP3已插人线性pET15b,见图2。

2.3.2酶切鉴定结果构建的表达载体经Xho I和BamH I双酶切后电泳鉴定,可见阳性克隆中含有长度约5700bp的pET15b和366bp的VP3条带,见图3。

2.3.3 pET15-VP3原核表达载体测序结果测序结果表明,VP3cDNA编码区成功地克隆了pET15b,且其序列与GeneBank中CAV中的VP3 cDNA序列完全一致,VP3序列在pET15b基因序列之后,见图4。

3讨论

基因工程的基本操作步骤包括目的基因提取、目的基因与运载体结合、将目的基因导人受体细胞、目的基因的检测和表达等,其中运载体的选择及运载体与目的基因的结合是基因工程成败的关键环节。本文中的运载体为pET15b,之所以选择pET15b,是因为pET15b作为运载体所表达的基因工程重组蛋白在其N端带有一个由6个组氨酸组成的“标签”,可在NF+NTA树脂柱进行亲合层析吸附,方便后期对表达的重组蛋白进行分离和纯化。在运载体与目的基因的结合中通常会遇到日的基因与运载体的酶切位点不匹配导致不易及不能正确连接的难题,人们常采用平端连接、限制性内切酶定向克隆和T—A克隆法等策略来加以解决,但这些方法增加了酶切、连接及T载体等环节,导致操作繁琐,成功率较低,使得这一在理论上十分方便的策略在实践上常常难以实现。在本文申,笔者采用了一种新的基因克隆方法,即:PCR产物靶向克隆法成功构建了pET159VP3原核表达载体,其与传统的克隆方法比较具有以下优势:①适合任何类型的克隆载体、插人片段、酶切位点;②只要线性化运载体就行(无论单双酶切均可);③不用酶切PCR产物,不用抹平末端,不用载体的去磷酸化;④可以避免出现正反方向插人的问题,实现靶向克隆;⑤插入的目的基因从起始密码子开始,没有两端多余的序列,不影响后续基因表达;⑥重组率高,重复性好,可靠性强。本方法的成功实施为利用基囚重组开发药物提供了另一条方便、快捷、高效的途径,所构建的pET15⒈VP3原核表达载体为进一步研究VP3基因的药用价值奠定了坚实的基础。

参考文献

[1]Noteborn MH.Apoptin acts as a tumor-specific killer:potentials for an anti-tumor therapy[J].Cellular and Molecular Biology,2005,(01):49-60.

[2]Noteborn MH.Proteins selectively killing tumor cells[J].European Journal of Pharmacology,2009,(03):165-173.

[3]Los M,Panigrahi S,Rashedi I.Apoptin,a tumor-selective killer[J].Biochimica Et Biophysica Acta,2009,(08):1335-1342.

[4]Sambrook J,Russell DW.分子克隆实验指南[M].北京:科学出版社,2002.96.

[5]Yao LL,Wang JN,Huang YZ.Construction of prokaryotic expression plasmid pET15b-PEP-1-CAT and expression and purification of PEP 1-CAT fusion protein[J].Nan Fang Yi Ke Da Xuc Xue Bao,2006,(09):1319-1325.

[6]朱玉贤.现代分子生物学[M].北京:高等教育出版社,2007.58.

[7]潘国栋,黄永章,郭凌郧.心肌α肌球蛋白重链启动子驱动的绿色荧光蛋白表达载体的构建及鉴定[J].郧阳医学院学报,2006,(02):70-73.

[8]Wang JN,Ding P,Huang YZ.The protective effect of PEP-1-SOD1 preconditioning on hypoxia/reoxygenation injury in cultured human umbilical vein endothelial cells[J].Zhonghua Xin Xuc Guan Bing Za Zhi,2007,(08):750-756.