大鼠脑出血后基质金属蛋白酶的动态表达及七叶皂苷钠对其表达的影响

作者：喻明，聂本刚，李小刚，杨小芳    作者单位：629000遂宁市人民医院神经内科

【关键词】  基质金属蛋白酶；七叶皂苷钠；脑出血； 脑水肿

    Dynamic expression of matrix metalloproteinase and the effect of sodium aescine in rats with intracerebral hemorrhage  YU Ming, NIE Bengang, LI Xiaogang, et al. Department of Neurology, Peoples Hospital of Suining, Suining 629000, China

    Abstract:Objective  To observe the relationship between dynamic expressions of matrix metalloproteinase2 (MMP2) and MMP9 protein and water contents in perihematoma, and the effect of sodium aescine in rats with intracerebral hemorrhage(ICH). Methods  250 Wistar rats were assigned randomly to four groups: normal control group (10 rats), sham operation group (80 rats), ICH group (80 rats) and sodium aescine treating group (80 rats). The water contents in perihematom and the expressions of MMP2 and MMP9 protein were measured respectively at 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 h, 120 h, 7 d and 15 d after operation in each group. Results  Neurological function deficit in sodium aescine treating group was improved compared with ICH group in 6 h～7 d (P<0.01～0.05). The water contents in perihematoma in treating group were reduced than in ICH group at 6 h～120 h (P<0.01～0.05). The expression of MMP2 protein in ICH group peaked at 6 h, and decreased at 12 h, it was significantly different from  normal control group (all P<0.01). The expression of MMP2 protein in treating group was reduced than in ICH group at different time point (all P<0.01), and the expression of MMP9 protein increased at 6 h, peaked at 24 h～48 h, and decreased at 72 h, the change had statistic significance compared with normal control group (all P<0.01). These expressions of MMP9 protein were positively correlated with water contents in perihematoma (r=0.949, P<0.05). The expression of MMP9 protein in treating group was reduced than in ICH group at different time point (all P<0.01). Conclusions  The expression of MMP2 and MMP9 protein plays important roles in the brain edema at early and middle period after ICH. Sodium aescine may reduce the expression of MMP2 and MMP9 protein and decrease water contents in perihematoma. This drug may have protective effect to ICH.

    Key words:matrix metalloproteinase; sodium aescine;intracerebral hemorrhage;brain edema

    基质金属蛋白酶（MMPs）是最重要的分解组织细胞外基质 (ECM)蛋白酶。脑血管主要表达MMP2、MMP9。七叶皂苷钠具有抗炎、抗渗出、抗水肿作用［1］，提高血浆促肾上腺皮质激素(ACTH)和糖皮质激素水平。本研究应用七叶皂苷钠对ICH模型干预，观察其对脑组织含水量及MMP2、MMP9蛋白表达的影响，探讨其脑保护作用的机制。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  动物与分组  健康成年Wistar大鼠 250只，雌雄各半，质量250～320 g，由泸州医学院动物中心提供。随机分为正常对照组（10只）、假手术组（80只）、ICH组（80只）、七叶皂苷钠治疗组（80只）。假手术组、ICH组、七叶皂苷钠治疗组制模后再随机分为6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、120 h、7 d和15 d 8个亚组，每亚组10只。

    1.1.2  仪器与试剂  WDTV型鼠脑立体定向仪(西安西北光电仪器厂)；50 μl微量进样器(上海激光医学仪器厂)；电热恒温烤箱(上海科析试验仪器厂)；一抗兔抗鼠MMP2、MMP9、二抗羊抗兔IgG、SABC试剂盒、多聚1赖氨酶、DAB显色试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。

    1.2  方法

    1.2.1  动物模型制备  采用Xue等［2］的方法制作大鼠ICH模型。用1%戊巴比妥钠30 mg/kg进行腹腔麻醉，头皮正中切开10 mm, 用30%双氧水腐蚀以暴露前囟及冠状缝，于颅骨背侧前囟前0.2 mm，中线右侧旁开3 mm钻一直径1 mm的孔，深度达硬脑膜表面不损及脑组织。将大鼠尾部放入温水中浸泡5 min，用75%乙醇消毒后剪去5 mm尾端，用微量进样器取血50 μl，固定微量进样器(针头直径5 mm)在立体定位仪上，沿钻孔进针，深约6 mm(此处为尾状核位置)，以10 μl/min速度将血推入脑内，留针10 min，然后缓慢退针(30 s)，钻孔用明胶海绵封闭，缝合皮肤。根据Berderson等［3］的评定方法将神经功能缺损程度分为4级。0级:无神经缺失症状；1级:将大鼠尾巴提起，瘫痪侧前肢回收屈曲于腹下，正常侧前肢向地面伸展；2级:除1级体征外，向瘫痪侧推大鼠时阻力较对侧明显降低；3级:除以上体征外，大鼠有向瘫痪侧旋转的行为。手术后2 h对大鼠神经症状进行评定，神经症状达1级及以上判断为模型制作成功。治疗组:制模前7d腹腔注射七叶皂苷钠50 mg/(kg·d），手术后继续给药，直到相应时间点被处死为止。ICH组、假手术组及正常对照组于相应时间点腹腔注射同体积生理盐水。

    1.2.2  神经功能缺损程度评分  各组大鼠分别在术前和术后各相应时间点处死前按Garcia等［4］方法进行神经功能评分,评分范围3～18分，分数越低，神经功能缺损程度越重。

    1.2.3  脑含水量测定  采用干湿重法，各组各时点处死动物5只，收集血肿边缘处的脑组织150 mg左右，称重并100℃烘烤48 h,脑含水量=(湿重－干重)/湿重×100%。

    1.2.4  MMP2、MMP9蛋白表达的测定  各时点取5只大鼠，麻醉后经主动脉予4%多聚甲醛灌注，取出脑组织放入4 %多聚甲醛中固定24 h后制作石蜡切片。免疫组化染色检测MMP2、MMP9的蛋白表达。采用阳性细胞记数法，每只大鼠每个指标选1张脑切片，在400倍光镜下随机选取血肿周围4个互不重叠视野，每个时点共计20个视野，计数每个视野的该指标阳性细胞数，取平均数。

    1.2.5  统计学方法  所测数值应用均数±标准差(±s)表示，应用SPSS 12.0统计软件，组间比较采用单因素方差分析(oneway ANOVA)的多个样本均数的两两比较法(LSD法)。相关分析应用Pearson相关分析。

    2  结  果

    2.1  各组不同时间点神经功能缺损程度评分比较  见表1。ICH后24～48 h神经功能缺损程度评分最低，与其他各时点相比，差异有统计学意义(均P<0.01)；治疗组神经功能缺损程度评分较ICH组明显改善，以6 h～7 d时明显，差异有统计学意义（P<0.01～0.05）。表1  各组不同时间点神经功能缺损程度评分比较注:与ICH组比较△P<0.05，▲P<0.01；与其他各时间点比较*P<0.01

    2.2  各组不同时间点脑组织含水量比较  见表2。ICH组制模后24～48 h脑组织含水量达高峰；治疗组6～120 h各亚组含水量较ICH组相应时间点明显减少，差异有统计学意义(P<0.05～0.01)，接近于正常对照组。

    2.3  各组不同时间点MMP2蛋白表达的比较  见表3。ICH组制模后6 h为MMP2蛋白表达高峰，与其他各时点相比，差异有统计学意义(均P<0.01)，ICH组各时间点MMP2表达与正常对照组及假手术组比较；差异有统计学意义(均P<0.01)；治疗组MMP2蛋白表达在各时间点较ICH组明显减少，差异有统计学意义(均P<0.01)。

    2.4  各组不同时间点MMP9蛋白表达的比较  见表4。ICH组制模后24～48 h MMP9蛋白表达达高峰，与其他各时点相比差异有统计学意义(均P<0.01)，与正常对照组及假手术组比较差异有统计学意义(均P<0.01)，治疗组MMP9蛋白表达在各时间点较ICH组降低(均P<0.01)。表2  各组不同时间点血肿周围脑组织含水量比较 注:与ICH组比较△P<0.05，▲P<0.01;与其他各时间点比较*P<0.01表3  各组不同时点MMP2蛋白表达的比较 注:与ICH组比较*P<0.01;与其他各时间点比较▲P<0.01表4  术后各组不同时点MMP9蛋白表达的比较 注:与ICH组比较*P<0.01;与其他各时间点比较△P<0.01

    2.5  MMP2、MMP9蛋白表达与脑含水量的关系  假手术组MMP2、MMP9蛋白表达与脑含水量不相关(r=0.135, r=-0.421,均 P>0.05)；ICH组、治疗组MMP2蛋白表达与脑含水量不相关(r=－0.009, r=－0.434, 均 P>0.05)；ICH组、治疗组MMP9蛋白表达与脑含水量呈正相关（r=0.949，r=0.907，均P<0.05）。

    2.6  MMP2蛋白与MMP9蛋白表达水平的关系  假手术组、ICH组及治疗组MMP2蛋白与MMP9蛋白表达水平不相关(r=－0.505, r=0.038, r=－0.076,均P>0.05)。

    3  讨  论

    MMPs是分解ECM的蛋白酶类中最重要的一类。脑组织中多种细胞可产生MMPs,包括胶质细胞、小胶质细胞、毛细血管内皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞。MMP2 和MMM9作用底物主要包括明胶、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原、弹性蛋白、层黏连蛋白、纤维连接蛋白、蛋白多糖。大多数MMPs基因的表达具有诱导性［5］。细胞因子、激素、生长因子等都可以增强MMPs基因的表达；而转化生长因子β、糖皮质激素等可下调其表达。MMPs合成与即早基因cfos和cjun的开放有关［6］。

    正常状态下脑血管内皮细胞有MMP2与MMP9低水平基础表达。Rosenberg等［7］在向大鼠尾状核注入0.5  U细菌胶原酶发现，4 h后形成含有坏死脑组织血肿，形成血肿的大小与胶原酶多少有关，随后又有研究发现，在ICH后16～24 h，MMPs上升，胶原酶剂量与血肿形成及继发脑水肿有密切关系，而在损伤后6 h用MMPs抑制剂BB1101治疗，可明显减少周围脑组织水分和盐离子含量的增多。Abilleira等［8］研究发现，ICH患者发病后24 h内MMP9浓度显著升高，与出血灶周围水肿程度呈正相关。

    七叶皂苷钠具有抗炎、抗渗出及消肿胀的作用，其机制可能是:(1)促进体内皮质醇类化合物的分泌作用，如用药后可使血浆ACTH含量提高10倍，使糖皮质激素水平提高20倍；增加前列腺素F2a的分泌，拮抗前列腺素E、缓激肽及5羟色胺（5HT）等炎性介质，降低血管通透性，起到抗炎、抗渗出作用；(2)减少血管渗出，改善微循环，有效清除局部水肿；(3)消除自由基，减轻血管内皮细胞损害，具有神经保护作用。有研究［9］发现，糖皮质激素可抑制MMPs的表达。七叶皂苷钠具有类激素作用，同样能抑制MMPs的表达，可能是通过提高血液激素浓度来调节MMPs的表达。

    本实验发现，大鼠ICH后神经功能缺损程度评分6 h已有明显下降，24～48 h神经功能障碍最严重；脑组织含水量也在制模后48 h达高峰，本实验结果也显示ICH后MMP2、MMP9蛋白的表达显著，表达部位主要为血肿区内与周边部位的毛细血管内皮细胞、胶质细胞、中性粒细胞、缺血神经元等，可能是由于血肿直接压迫脑组织，引起周围局部脑血流量(rCBF)降低，细胞功能发生改变，刺激炎性细胞、神经元、内皮细胞和胶质细胞［10］或ICH后大量自由基、凝血酶产生，激活了MTMMPs，从而激活MMPs系统［11,12］。MMP2、MMP9不仅仅被动作为炎症反应的下游产物而出现，它还对许多促炎因子发挥正反馈作用，是炎症反应重要调节剂，从而加重脑水肿，使神经功能缺失进一步加重。

    本实验发现，MMP9蛋白在ICH 6 h时表达已明显上升，24～48 h达高峰，以后逐渐下降，与脑含水量变化基本一致，提示ICH后MMP9被释放和激活，促进基底膜降解，血脑屏障通透性增加，造成血肿边缘的脑组织含水量增加。制模后6 h时出现MMP2蛋白表达高峰，12 h后逐渐下降；由此推测ICH后MMP2在早期过度表达，可能主要在早期破坏血脑屏障，促进血管源性脑水肿形成；而MMP9主要在中、晚期参与血脑屏障破坏，加重脑水肿。

    Harkness等［13］研究发现，地塞米松在中枢神经系统能抑制血管内皮细胞MMP2、MMP9的表达，降低血脑屏障的损害。另有研究［8］表明，糖皮质激素通过Fos/Jun二聚体形成复合物，阻止其与激活蛋白（AP）1的结合而抑制MMP9基因转录。本研究显示，通过七叶皂苷钠干预，ICH后MMP2 、MMP9表达明显减少，提示七叶皂苷钠能抑制MMPs蛋白的表达。七叶皂苷钠具有类激素作用，抑制肿瘤坏死因子、白介素（IL）6、自由基的表达，或上调抗炎细胞因子IL10的表达，抑制MTMMPs激活［11］，从而抑制MMPs基因蛋白表达水平，发挥脑保护作用。

【参考文献】［1］张勇，丁新生，高飞，等.大鼠脑出血后神经细胞凋亡和蛋白激酶B表达及β七叶皂甙钠的干预作用［Ｊ］.临床神经病学杂志,2006,19:50.

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