体外循环时乌司他丁对CD14+单核细胞表面Toll样受体4表达

　　作者：刘敏　　作者单位：上海中医药大学附属中西医结合医院麻醉科，上海 200437

　　【摘要】目的 探讨体外循环(CPB )时血液中CD14+单核细胞表面Toll样受体4(TLR4)及其胞内热休克蛋白70(HSP70)表达的变化规律以及乌司他丁对外周血液中CD14+单核细胞表面TLR4 受体表达的影响。方法 选择我院2006年8月至2007年8月期间择期行房、室间隔缺损修补手术患者30 例，随机分为对照组和乌司他丁组，每组15例。全麻诱导前乌司他丁组给予乌司他丁12000 UI/kg ,对照组给予同样体积的生理盐水。分别于麻醉诱导前(T1)、CPB前(T2)、主动脉开放时(T3) 、主动脉开放30 min (T4)、术后5h(T5)、术后第2天晨8 时(T6)采集动脉血,以流式细胞仪检测CD14+单核细胞表面TLR4和HSP70表达变化; ELSIA检测上述各时点TNFα、IL6的血浆浓度。结果 两组在T2～T6的CD14+单核细胞表面TLR4受体和其胞内HSP70表达以及TNFα、IL6血浆浓度均较T1的增加(均P<0.01或0.05);乌司他丁组各指标值均较对照组的上升幅度低(均P<0.01或0.05)。结论 CPB时静脉应用乌司他丁可能通过减少HSP70等内源性危险信号产生，抑制TLR4受体表达而减轻CPB导致的全身炎性反应。

　　【关键词】 体外循环,乌司他丁,Toll样受体4 热休克蛋白70

　　TOLL样受体(Tolllike receptors,TLR)是保守的与病原相关的分子模式的识别受体,TLRs家族在天然免疫和获得性免疫中起着中心作用[1]。研究表明,TLR4除了识别微生物外源性物质外,机体的坏死细胞[2]和热休克蛋白(HeatShock Protein,HSP) 70 等[3]内源性物质也可通过TLR4进行信号转导。本研究旨在探讨体外循环(CPB)时血液中CD14+单核细胞表面TLR4受体及单核细胞内HSP70表达的变化规律以及乌司他丁对外周血液中CD14+单核细胞表面TLR4受体表达的影响。

　　1 资料与方法

　　1.1 研究对象

　　将我院2006年8月至2007年8月期间拟择期行房、室间隔缺损修补手术先天性心脏病住院患者(美国麻醉医师协会(ASA) 分级I～ II级)30 例随机分为乌司他丁组和对照组,每组各15例。患者年龄20～50 岁，均无肺部疾病，4 周内无感染、发热、过敏症状、异常血细胞计数、肝肾功能异常。

　　1.2 麻醉处理

　　术前30 min肌注东莨菪碱0.3 mg,吗啡5 mg。诱导前乌司他丁组静注乌司他丁12000 UI/kg，对照组给予同样体积的生理盐水。麻醉诱导插管，持续输注异丙酚，间断推注芬太尼、哌库溴胺以维持麻醉。CPB 采用德国Josra 滚压泵、膜肺和储血器。采用全身中度低温、中度血液稀释，预充液为30 mL/kg，不用抑肽酶和糖皮质激素。CPB 期间灌注流量为每50～70 mL/(kg•min)，维持平均动脉压在50～70 mmHg。手术操作结束，给予鱼精蛋白中和肝素(1.5∶1)，术毕送患者回ICU监护。

　　1.3 标本采集与处理

　　分别于麻醉诱导前(T1)、CPB前(T2)、主动脉开放时(T3)、主动脉开放30 min (T4)、术后5h(T5)、术后第2天晨8时(T6)采集动脉血，并以肝素充分抗凝，离心分离血浆1 mL置于-70 ℃冰箱备用。血标本于24 h内进行直接免疫荧光标记单核细胞表面CD14和TLR4,以流式细胞仪(美国B D公司FACS Calibur) 检测TLR4及HSP70的表达变化。用Ebioscience公司ELISA试剂盒检测血浆TNFα和IL6浓度。为消除血液稀释对结果的影响，以麻醉诱导前的HCT测定值为基础值，用Taylor公式校正各指标实测数据：稀释后物质含量校正值=实测值×麻醉诱导前的红细胞压积/取样时的红细胞压积。

　　1.4 统计学处理

　　采用SPSS13.0 统计软件，计量资料用均数±标准差表示，采用完全随机设计的t检验、单因素方差分析和Dunnett检验对数据进行处理, P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 T1～T6时点的TNFα和IL6的浓度变化

　　两组T2～T6时点的TNFα和IL6值较T1的高，差异有统计学意义(均P<0.01)，乌司他丁组T2～T6时点TNFα和IL6的浓度均显著低于对照组相应时点的值(均P<0.01)，详见表1。

　　2.2 T1～T6时点外周血CD14+单核细胞内HSP70的表达变化(荧光强度MFI)

　　乌司他丁组T1～T6时点外周血CD14+单核细胞内HSP70的表达在整个CPB过程中变化不明显;对照组在T2后开始显著升高(均P<0.01)。乌司他丁组外周血CD14+单核细胞内HSP70的表达在T2后的时点均显著低于对照组同一时点的值(均P<0.01)，详见表2。

　　2.3 T1～T6时点外周血CD14+单核细胞表面TLR4的表达变化(略)

　　与组内T1相比*P<0.01;与对照组同一时点相比# P<0.01。

　　表2 T1～T6时点外周血CD14+单核细胞内HSP70的表达变化(略)

　　与组内T1相比*P<0.01;与对照组同一时点相比#P<0.01。

　　两组外周血CD14+单核细胞表面TLR4的表达(FITCantiHSP70和PEantiTLR4双阳性单核细胞在T1～T6时点阳性率%)在T2后均较本组T1的显著升高(P<0.05或0.01)，乌司他丁组在T2后的各个时点均显著低于对照组同一时点的(均P<0.01)，见表3。

　　表3 不同时点外周血CD14+单核细胞表面TLR4的表达变化 (略)

　　与组内T1相比*P<0.05，**P<0.01;与对照组同一时点相比#P<0.05，##P<0.01。

　　3 讨论

　　TLR体是I型跨膜受体，其家族在识别内源性和微生物感染的外源性危险信号的分子标志、诱导抗微生物基因和控制获得性免疫应答中起关键性作用。TLRs 能特异性地识别病原相关分子模式，通过跨膜结构将病原相关分子刺激信号转导入细胞内，产生复杂的级联信号反应，导致NFB、IFN诱导因子等转录因子活化，介导IL1、IL6、IL8、IFNα以及TNFα等炎性介质基因的表达,引起相应炎性介质的合成和释放，趋化和激活嗜中性白细胞，活化淋巴细胞，启动针对病原微生物的固有和获得性免疫。

　　乌司他丁是一种高效广谱的水解酶抑制剂，对中性粒细胞蛋白酶具有较强的抑制作用，还能抑制白细胞释放炎性介质。乌司他丁可能是通过阻断蛋白酶所介导的中性细胞聚集，从而减轻了炎性介质与氧自由基的释放，有效制约了酶、细胞因子、氧自由基级联反应所形成的恶性循环和放大效应[4]。

　　本研究表明，不同时点CD14+单核细胞内HSP70的平均荧光强度及细胞表面TLR4的表达表现出规律性变化，即麻醉诱导后开始升高，主动脉开放30 min达高峰，随后开始下降，直到术后第2d早晨仍稍高于术前，这与有关研究的结果[5]是一致的。本研究结果还显示乌司他丁组在麻醉诱导后CD14+单核细胞内HSP70的平均荧光强度及细胞表面TLR4的表达均强于对照组，同时TLR4与HSP70呈现一致性变化，一方面说明了单核细胞释放中的HSP70 可能是血浆HSP70的来源之一;另一方面也说明了CPB后全身性炎性反应可能与HSP70 兴奋其受体TLR4 有关。同时也揭示了乌司他丁可有效抑制CD14+单核细胞内HSP70及CD14+单核细胞表面TLR4的表达。乌司他丁对HSP70的抑制作用可能是通过抑制热休克转录因子1调节基因从而抑制HSP70的合成;乌司他丁对TLR4的抑制作用可能是直接作用，也可能是抑制了其配体产生，但其机制还有待进一步证实。

　　TNFα是激活的巨噬细胞分泌的炎性细胞因子网络中的关键成分，有诱导成纤维细胞及血管内皮细胞产生巨噬细胞集落，激活其他细胞因子的功能，参与炎症反应的全过程[6]。IL6可由多种类型的细胞分泌产生，在反应的急性期和机体防御中起核心作用，可诱导产生急性期蛋白，还可作为急性炎症反应和反映CPB 术后炎症反应程度的标志之一，可以提示感染性休克患者CPB后所致的全身炎性反应(SIRS) 的病情程度和预后[7]。本研究结果表明， TNFα、IL6均在麻醉诱导后开始升高，TNFα在主动脉开放30min后达到高峰，IL6在术后5h达高峰，以后均开始下降，但直到第2d 仍显著高于正常值。他们的变化过程与TLR4、HSP70 的表达变化过程一致。本研究结果显示，乌司他丁可明显抑制了TNFα、IL6炎性介质的产生，同时也揭示了TLR4的表达上调可能是CPB后全身炎性反应产生的原因，因此乌司他丁对SIRS的治疗作用可能与抑制TLR4的过度表达有关。

　　TLR4 可以作为治疗CPB导致的全身炎性反应综合征的新靶点,乌司他丁可通过减少HSP70等危险信号产生或(和) 直接抑制TLR4受体表达而达到抗炎作用，减轻CPB导致的全身炎性反应。

　　【参考文献】

　　[1] Medzhitov R. Tolllike receptors and innate immunity[J]. Nat Rev Immunol,2001,1(2):135145.

　　[2] Li M,Carpio D　F,Zheng Y, et al. An essential role of the NFκB/Tolllike receptor pathway in induction of inflammatory and tissuerepair gene expression by necrotic cells[J]. J Immunol ,2001 ,166(12):7128  7135.

　　[3] Asea A,Rehli M, Kabingu E , et al . Novel signal transduction pathway utilized by extracellular HSP70 : role of tolllike receptor ( TLR) 2 and TLR4[J]. J Biol Chem, 2002,277(17) :15028  15034.

　　[4] ThomaUszynski S, Stenger S,Takemchi O, et al. Induction of direct antimicrobial activity through mammalian Tolllike receptors[J]. Science , 2001 ,291(5508)：1544  1547.

　　[5] Atabai K，Matthay A M.The pulmonary physician in critical care 5: Acute lung injury and the acute respiratory distress syndrome：definitions and epidemidogy[J].Thorax，2002，57(5)：452458.

　　[6] Park W Y, Goodman R B, Steinberg K P, et al. Cytokine balance in the lungs of patients with acute respiratory distress syndrome[J]. Am J Respiratory Crit Care Med,2001, 164 (10Pt1):18961903.

　　[7] Pinsky M R ,Vincent J L ,Deviere J ,et al . Serum cytokine levels in human septic shock. Relation to multiple system organ failure and mortality[J]. Chest ,1993 ,103(2):565575.