雌激素对紫外线作用下人永生化角质形成细胞的保护作用

　　作者：仇金鹏 李澄 任明 胡玉琳 佟倜 王艳姝 作者单位：吉林大学第一医院麻醉科，吉林 长春 130021

　　【摘要】目的 探讨雌二醇(17βE2)对中波紫外线(UVB)照射下人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)的保护作用。方法 将体外培养的HaCaT细胞随机分为3组：正常组、UVB组、E2组，分别加入不同的处理因素，UVB组在UVB灯下照射6 min后继续培养，E2组照射前预先给予17βE2使其终浓度达107 mol/L，正常组不加处理因素;照射结束后继续培养12 h后收集细胞，测定各组细胞的超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平以及细胞内钙离子浓度和细胞线粒体膜电位的变化。结果 与正常组比较，UVB组和E2组细胞线粒体膜电位显著降低(P<0.05)，细胞内钙离子浓度显著升高(P<0.05)，SOD水平显著降低(P<0.05)，MDA水平显著升高(P<0.05);与UVB组相比较，E2组细胞线粒体膜电位显著升高(P<0.05)，细胞内钙离子浓度差别不显著(P>0.05)，SOD水平显著升高(P<0.05)，MDA水平显著降低(P<0.05)。结论 17βE2可通过抗氧化和抗凋亡作用拮抗UVB引起的HaCaT细胞损伤，对UVB照射下的HaCaT细胞具有保护作用。

　　【关键词】 17β雌二醇;HaCaT细胞;中波紫外线(UVB)

　　接触过多的紫外线可以使人类的皮肤癌、白内障等疾病的发病率升高。紫外线可以通过损伤皮肤细胞DNA，诱发自由基和细胞因子/炎症趋化因子的产生，产生脂质过氧化损伤对皮肤造成光损伤导致皮肤衰老甚至引发皮肤癌〔1～3〕。雌激素作为一种甾体类激素，可以通过影响皮肤厚度、湿度、弹性、血管供应、色素沉着来阻止皮肤老化，在抗皮肤衰老方面，有其独到之处〔4，5〕，有研究表明雌激素可以抑制氧自由基(ROS)产生，减少氧化应激，具有一定的抗氧化和抗凋亡作用〔6〕，然而对于雌激素对人角质形成细胞(HaCaT细胞)是否具有保护作用，通过什么途径进行保护还知之甚少。因此，本实验预先用雌二醇(17βE2)处理HaCaT细胞来观察其对中波紫外线(UVB)照射导致细胞损伤的影响，探讨雌激素的作用机制，为研究皮肤光老化发生中17βE2的作用提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与仪器

　　RPMI1640培养基、胰蛋白酶(Gibco，美国)、台盼蓝(Amresco，美国)、MDA试剂盒(南京建成)、DMSO(Sigma，北京鼎国分装，美国)、FAC Scan流式细胞仪(Bection Dickinson FACScalibur，美国)、生物显微镜(CH型，OLYMPUS，日本)、UVB灯(15W，上海顾村光电仪器厂)、Fluo3/AM(Biotium，美国)、罗丹明 123(Sigma，美国)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养

　　HaCaT细胞在37℃、5%CO2条件下培养于含10%标准胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基中。当细胞融合至85%～90%时传代，弃掉培养液，PBS冲洗2遍，用0.25%胰酶常规消化，用含血清的培养液迅速终止消化，制成单细胞悬液。细胞计数，按1×105接种于100 mm培养皿中备用。

　　1.2.2 分组及处理

　　当培养皿内细胞融合达60%左右时，将细胞随机分为正常组、UVB组、17βE2组。弃掉旧培养液，用高压灭菌的PBS冲洗3遍后，正常组和UVB组加入含1%FBS的10 ml RPMI1640培养液，17βE2组加入5 μl 0.2 mmol/L雌激素+含1%FBS的10 ml RPMI1640培养液，放培养箱中继续培养24 h后弃掉旧的培养液，用高压灭菌的PBS冲洗3遍，向每个平皿内加入4 ml PBS，使之能浸没整个平皿底。UVB组和17βE2组打开平皿盖在15 W的UVB灯正下方照射6 min，正常组细胞用锡纸盖住。照射后，立即弃掉平皿内PBS，加入4 ml 4℃预冷的PBS冲洗3遍。之后加入RPMI1640培养液于培养箱继续培养12 h后收获各组细胞备用。

　　1.2.3 细胞内钙离子 ( [Ca2+] i) 浓度测定

　　将各组细胞常规消化后制成单细胞悬液，用PBS调整细胞计数至106个/ml。取含有5×105个细胞的悬液至1.5 ml微量离心管中;向微量离心管中加入Fluo3/AM Ester(终浓度5 μmol/L)，混匀;在37℃孵箱中避光反应45 min后用PBS洗涤2次(1 500 r/min，5 min);在流式细胞仪(FCM)检测，检测条件为激发波长488 nm、发射波长530 nm。

　　1.2.4 细胞线粒体膜电位(△Ψm)测定

　　各组细胞消化后制成单细胞悬液，用PBS调整细胞计数至106个/ml。取含有5×105个细胞的上述细胞悬液至1.5 ml微量离心管中;向微量离心管中加入Rh123(终浓度5 mg/L)，混匀;在37 ℃孵箱中避光反应45 min后PBS洗涤细胞 2次(1 500 r/min，5 min);在流式细胞仪(FCM)检测，检测条件为激发波长488 nm、发射波长530 nm。

　　1.2.5 总超氧化物歧化酶(SOD)测定

　　细胞中SOD能清除超氧阴离子自由基(O22)，保护细胞免受损伤。受UVB照射后的细胞超氧阴离子自由基增高，细胞中SOD对自由基进行清除从而含量减少。O22可氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂作用下呈紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。当被测样品中含有SOD 时，则对O2有专一性抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管吸光度，通过公式可以计算出被测样品中的SOD活力。

　　总SOD活力(U/ml)=对照管吸光度-测定管吸光度对照管吸光度÷50×反应体系的稀释倍数×样本测试前稀释倍数。

　　1.2.6 丙二醛(MDA)含量测定

　　采用硫代巴比妥酸反应比色法。

　　1.3 统计学处理

　　采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析(oneway ANOVA) 。

　　2 结 果

　　2.1 17βE2对紫外线作用下HaCaT细胞△Ψm和[Ca2+] i浓度的影响

　　与正常组比较，UVB组和17βE2组的△Ψm均显著下降(P<0.05);17βE2组的△Ψm显著高于UVB(P<0.05)。正常组的[Ca2+]i显著低于UVB照射组和17βE2组(P<0.05);17βE2组细胞的[Ca2+]i与UVB组相比较，差异不显著(P>0.05)。见表1。表1 17βE2对紫外线作用下HaCaT细胞△Ψm和[Ca2+]i浓度的影响(略)

　　2.2 各组细胞MDA含量及SOD活性检测结果

　　与正常组细胞比较，17βE2组和UVB照射组细胞MDA含量均显著升高(P<0.05)，SOD活性显著下降(P<0.05);与UVB组细胞相比较，17βE2组细胞MDA含量显著下降(P<0.05)，SOD活性显著升高(P<0.05)(见表2)。表2 17βE2对紫外线作用下HaCaT细胞氧化损伤的影响(略)

　　3 讨 论

　　引起皮肤损伤的紫外线主要是长波紫外线(UVA)和UVB，而UVB对皮肤的损伤程度要比UVA大1 000倍。UVB的波长为280～320 nm，随着波长的增加，UVB对皮肤的穿透深度可达0.01～10 mm，可作用的组织从表皮浅层到表皮深层，甚至真皮层〔7，8〕。UVB可通过辐射产生自由基，造成皮肤组织氧化损伤，被认为是最主要的致癌紫外线波段〔9〕。雌激素是一种甾体类激素，主要来源于卵巢和肾上腺皮质，主要包括17βE2、雌酮及其代谢产生的雌三醇等，其中17βE2作用最强。雌激素在抗皮肤老化、加速皮肤损伤修复、促进毛发生长及抑制皮脂腺分泌等方面均发挥重要作用〔6〕。研究表明，雌激素也是一种损伤修复调节因子，在人类和动物模型中，可以逆转年龄相关的损伤愈合，局部或系统应用雌激素能减轻炎症反应，减少炎症因子的产生，明显提高机体的免疫反应，促进伤口愈合〔10～12〕。雌激素不仅对年龄相关的皮肤老化起作用，对其他的物理因素(如光损伤)引起的老化也有明显的修复作用，能够通过保护血管内皮抑制动脉粥样硬化形成，还能中和氧自由基从而抑制脂质过氧化过程〔6〕。本研究结果说明雌激素能够提高△Ψm，降低[Ca2+] i浓度，维持线粒体的氧化磷酸化，减少内源性自由基的产生，同时降低细胞内由于照射产生的脂质过氧化产物MDA的含量，从而抑制脂质过氧化作用，减轻UVB对细胞的损伤，拮抗紫外线所致的皮肤损伤作用，对皮肤细胞起到一定的保护作用。

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