细胞因子在小鼠支气管哮喘发病中的作用及梓醇的治疗效应

　　作者：娄晓平 何巧洁1 曹莉锋1 郭莲英2 邢 嵘2 作者单位：大连大学附属中山医院麻醉科，辽宁 大连 116011)

　　【摘要】 目的 研究细胞因子IL4、IL5、IL8、IFNr及 NO与哮喘发生的关系，观察中药梓醇对支气管哮喘的治疗作用。方法 将30只Balb/c小鼠随机分为三组：生理盐水对照组、哮喘模型组、梓醇治疗组，每组各10只。除对照组外，余两组采用卵蛋白和氢氧化铝混合溶液注射致敏，并雾化吸入建立哮喘模型。治疗组小鼠从第15天起每次雾化攻击前1 h给予梓醇5 mg/kg腹腔注射，连续7 d。其余两组用生理盐水替代卵蛋白进行注射。第22天处死小鼠，收取血清，并取其肺、脾组织，制备支气管肺组织匀浆，收集支气管肺泡灌洗液(BALF)，脾淋巴细胞和巨噬细胞培养上清液。用放射免疫法检测IL8的水平，酶联免疫法(ELISA)检测IFNγ、IL4、IL5的水平，用酶法检测 NO含量，计数小鼠BALF中白细胞的数量。结果 哮喘模型组肺泡灌洗液中白细胞计数、支气管肺组织中IL4、 脾淋巴细胞培养上清液中IL5、血清与脾淋巴细胞培养上清液中IL8含量及脾巨噬细胞培养上清液中NO含量明显高于对照组(P<0.01);而治疗组上述指标明显低于哮喘模型组(P<0.01或P<0.05);哮喘模型组脾淋巴细胞产生INFγ含量明显低于对照组,治疗组明显高于哮喘模型组(P<0.01)。结论 细胞因子IL4、IL5、IL8、IFNγ和NO水平的变化反映了Th1和Th2的失衡和巨噬细胞功能的增强，可能参与了哮喘发病的病理生理过程,中药梓醇对支气管哮喘有一定的治疗作用。

　　【关键词】 支气管哮喘;淋巴细胞;巨噬细胞;梓醇

　　目前研究表明：Th1/Th2亚群比例失衡和功能失衡是哮喘主要免疫发病机制〔1〕。迄今为止，糖皮质激素仍被认为是当前治疗哮喘发作中最有效的药物，但激素治疗即使局部吸入治疗也有可能发生严重的全身和局部副作用。目前国内有应用多种中药治疗哮喘已取得了一定的进展，其机制在于中药可以调节Th1/Th2的失衡状态。梓醇为地黄滋阴作用的有效成分之一,地黄的药理作用包括抗衰老、降血糖、利尿、强心、抗凝血、提高免疫功能等〔2，3〕。为探讨哮喘的免疫学发病机制以及梓醇对哮喘小鼠的免疫调节作用，本研究以卵蛋白致敏小鼠为哮喘模型，通过对IL4、IL5、IL8、INFγ及NO水平的测定，分析T淋巴细胞和巨噬细胞在哮喘发病中的可能性作用，并观察梓醇对免疫功能的调节作用，以分析其对哮喘治疗的效果。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 药品与试剂 卵蛋白(OVA，购自美国Sigma公司);氢氧化铝(北京市朝阳区和平街化工厂);IL4、IFNγ ELISA检测试剂盒(购自深圳晶美生物工程有限公司);IL5定量酶联检测试剂盒(购自尚柏生物工程有限公司);IL8放免试剂盒(购自解放军总医院科技开发中心放免所);0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2);考马斯亮蓝(上海化学试剂公司);梓醇粉剂(购自中国药品生物制品检定所，化学对照品110808200407)。

　　1.1.2 仪器设备 402型超声雾化器(上海合力医用器械厂);多孔酶标测定仪(Multiskan Ascent Vl.24 ClinBio 120C);721分光光度计;96孔培养板(Corning,USA);高速离心机(EVOLUTION TMKC,USA)等。

　　1.2 方法

　　1.2.1 实验分组和模型的建立 清洁级Balb/c小鼠30只，6～8周龄，雌雄各半，体重18～22 g，随机分为3组：对照组(10只)、模型组(10只)和治疗组(10只)。对照组：于实验第1天和第8天分别腹腔注射生理盐水0.2 ml，于实验第15天起将小鼠置于密闭容器内，生理盐水雾化攻击，每日1次，每次30 min，连续7 d。 模型组：于实验第1天和第8天分别腹腔注射OVA抗原液0.2 ml(含卵清蛋白100 μg和氢氧化铝1 mg)致敏2次;于实验第15天起将小鼠置于密闭容器内，以60 g/L的OVA溶液雾化攻击，每日1次，每次30 min，连续7 d。 治疗组：致敏方式同模型组，而从第15天起每次雾化攻击前1 h给予梓醇5 mg/kg腹腔注射，连续7 d。当致敏小鼠反应出现点头呼吸用力呼吸等症状时，表示哮喘激发成功。3组小鼠在同一条件下喂养。

　　1.2.2 支气管肺泡灌洗液(BALF)的获得与处理 末次雾化攻击18～24 h后小鼠眼球取血，取血后气管切开，插入连接注射器的胶管注入0.5 ml 37℃的PBS(pH=7.2)0.5 ml进行支气管肺泡灌洗，反复共3次，收取灌洗液,1 000 r/min离心10 min，收集上清液即BALF，-70℃保存。沉淀物用PBS稀释后涂片，进行细胞计数。

　　1.2.3 肺组织匀浆的制备 小鼠眼球取血，放血后打开胸腔，取出肺组织，加入组织块重量9倍的生理盐水，制成10%肺组织匀浆，以3 000～4 000 r/min离心15 min，取上清液于-70℃保存待用。

　　1.2.4 脾不黏附细胞及巨噬细胞培养上清液制备 各组小鼠最后一次激发24 h后脱臼处死，于75%乙醇浸泡5 min后，在无菌条件下于腹股沟区用剪刀和镊子做U型切口，剪开皮肤和腹壁，暴露脾脏，将脾脏与其血管和结缔组织剥离并取出，立即放入盛有冷PBS的无菌培养皿中。然后将脾脏放在200目的尼龙网上，用1 ml玻璃注射器芯研磨脾脏，收集细胞悬液，1 500 r/min离心5 min，弃上清，用高渗氯化钠溶液(HS)低渗液破碎红细胞，PBS洗3次，用含10%小牛血清的RPMI1640全培基重悬细胞，放入培养瓶中，置于37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养2 h。收集非贴壁细胞，此即脾混合淋巴细胞，收集贴壁细胞即为巨噬细胞。用RPMI1640全培基调细胞浓度，加入新的培养瓶中，继续培养48 h后，收集培养上清液，-70℃保存。

　　1.2.5 细胞因子和NO水平测定IL8的检测 取血清、脾不黏附细胞培养上清液，采用美国DPC公司γ12计数器,采用放射免疫法，按照IL8放免试剂盒说明进行操作。

　　1.2.6 IL4、IL5、IFNγ的检测 采用ELISA双抗体夹心法加100 μl标准品及待测样品至抗IL4、IL5、IFNγ单克隆抗体包被的96孔反应板中,室温孵育120 min,洗板后加入生物素化的抗小鼠IL4、IL5、IFNγ及辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素,洗板后加入TBM显色,置反应板于酶标仪上读取OD(450 nm)值,制备标准曲线,求出IL4、IL5、IFNγ的量。

　　1.2.7 NO的测定 采用硝酸酶还原法测定，按照试剂盒说明进行操作，用721分光光度计，在546 nm波长处比色，测定NO3浓度，以反映NO的水平。

　　1.3 统计学方法 实验数据以x±s表示，采用SPSS10.0软件包对组间进行t检验。

　　2 结 果

　　2.1 模型动物临床症状 以1% OVA雾化吸入后30 min内,小鼠出现点头呼吸用力呼吸等症状时，表示哮喘激发成功。

　　2.2 BALF中白细胞总数变化 与对照组〔(21.500±10.017)×104/ml〕相比，模型组BALF中白细胞总数〔(64.600±18.555)×104/ml〕明显增加(P<0.01)。而梓醇治疗组BALF中白细胞总数〔(23.400±15.110)×104/ml〕明显低于哮喘模型组(P<0.01)。

　　2.3 肺组织IL4水平，脾不黏附细胞培养上清液IL5和IFNγ水平 哮喘模型组中IL4，IL5水平显著增加，与对照组相比有显著差异(P<0.01)，经梓醇治疗后，治疗组中IL4，IL5水平明显低于哮喘模型组(P<0.01);哮喘模型组中IFNγ含量明显低于对照组(P<0.01)，治疗组明显高于哮喘模型组(P<0.01)。见表1。表1 各组小鼠肺组织IL4与脾不黏附细胞培养上清液IL5和 IFNγ的水平1)与对照组比较，2)与模型组比较：均P<0.01，下表同

　　2.4 血清与脾不黏附细胞培养上清液IL8水平 哮喘模型组中血清与脾不黏附细胞培养上清液IL8水平显著增加，与对照组相比有显著性差异(P<0.01)，治疗组IL8水平明显低于哮喘模型组，有显著性差异(P<0.01)。见表2。表2 各组小鼠血清与脾不黏附细胞培养上清液IL8水平

　　2.5 脾巨噬细胞培养上清液NO含量 哮喘模型组脾巨噬细胞培养上清液NO含量〔(532.300±57.725) μmol/L〕显著增加，与对照组〔(413.500±29.744) μmol/L〕相比有显著差异(P<0.01)，治疗组NO含量〔(433.167±12.077) μmol/L〕明显低于哮喘模型组(P<0.05)。

　　3 讨 论

　　许多研究证实，免疫失调是支气管哮喘发病的重要因素，急性发作时， Th1/Th2细胞比例失衡平衡状态,Th1细胞分泌细胞因子IFNγ减少，Th2细胞分泌细胞因子IL4和IL5、IL8分泌增多〔4〕。本实验也证实了此结果。支气管哮喘又是一种以嗜酸性粒细胞(EOS)、肥大细胞(MC)、T淋巴细胞反应为主的气道反应性炎症和以气道高反应为特征的疾病〔5〕。本实验模型组BALF中白细胞总数明显高于对照组的结果,与这些分析一致。表明支气管哮喘的发生确有多种炎性细胞的参与。通过对实验小鼠脾巨噬细胞培养上清液中NO含量的测定，发现模型组NO水平较对照组明显升高,其机制主要是由于过敏原、炎症细胞因子及淋巴细胞等进一步诱导气道上皮细胞、巨噬细胞及中性粒细胞等合成诱生型一氧化氮合酶(INOS)增多,产生大量NO所致〔6〕。高浓度NO可选择性抑制Th1细胞增殖和IL2、γ干扰素的产生,使Th2细胞大量增殖,促使释放IL4、IL5等细胞因子,加重气道嗜酸性细胞浸润。过量的NO同时扩张支气管黏膜血管,使毛细血管渗出增加,黏膜水肿加重,进一步加重气道阻塞,使呼吸困难加重〔7〕。由此可见，哮喘患者体内淋巴细胞激活与内源性NO水平有关。NO在哮喘气道炎症和调节Th1/Th2平衡中起关键作用。

　　目前,哮喘的治疗方法很多,仍不能脱离糖皮质激素和β2R兴奋剂吸入疗法，用药时间长,产生不可避免的副作用〔8〕。OVA诱导哮喘鼠模型实验中发现，这些药物仅限于临床疗效的观察,动物实验研究较少,中药复方发挥疗效的有效成分、作用方式和靶点等机制尚不清楚。因此对临床上用于治疗哮喘的确实行之有效的中药制剂的药理、药效和作用机制进行研究已成为目前的热点。尽管目前有关支气管哮喘的发病机制至今仍不完全清楚,但是很多研究表明支气管哮喘的发病与多种炎性介质、细胞因子及炎性细胞的活动有关。因此调整机体免疫状态来治疗哮喘，会有效改善病症。本实验也显示了此结果。地黄的药理作用与滋阴作用有关,目前所知,地黄的特征成分主要是环烯醚萜类化合物,其中最主要的是梓醇,中国药典指定其为地黄的定性指标〔9〕，它是地黄滋阴作用的有效活性成分，关于它滋阴作用的理论研究已见报道。但是长期以来对梓醇的药理研究很少,仅知它有一定的利尿、降血糖及迟效性缓和泻下。从本实验结果可以看出用梓醇治疗后的小鼠BALF中白细胞计数，肺、脾淋巴细胞培养上清液中IL4、IL5、IL8含量及脾巨噬细胞培养上清液NO含量明显低于模型组，有统计学意义,说明梓醇可能通过滋阴作用，提高免疫功能反应来抑制炎性介质的释放来保护肺组织，从而减轻哮喘的程度而起到治疗作用。

　　本研究结果表明,小鼠支气管哮喘急性发作期体内细胞因子IL4、5、8及NO水平增高,IFNγ水平降低,而经梓醇治疗后IL4、5、8及NO水平降低，IFNγ水平升高，进一步证实了Th1/Th2细胞亚群失衡在哮喘的发病中起着重要的作用。从实验结果也得出梓醇作为治疗支气管哮喘的中药成分之一值得考虑。

　　【参考文献】

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