钙离子对坐骨神经腓肠肌神经肌肉接头神经递质释放的作用

　　作者：王宏 李红芳 陈方 赵润平 王成祥 顾维刚 韩杰 

　　【摘要】  目的 探讨神经突触小体中神经递质量子释放的机制，并提出假设予以验证，从而明确Ca2+在这一过程中的作用。方法 应用钙通道阻滞剂异搏定、蛋白激酶A的阻滞H89选择性作用于分离的蟾蜍坐骨神经腓肠肌标本上，通过观察腓肠肌的收缩程度，验证实验假设机制。结果 Ca2+组收缩曲线的振幅较正常组收缩曲线的振幅大（P<0.05）；异搏定组收缩曲线的振幅较正常组收缩曲线的振幅小（P<0.05）；H89组收缩曲线的振幅较正常组收缩曲线的振幅小（P<0.05）；Mg2+组收缩曲线的振幅较正常组收缩曲线的振幅小（P<0.05）。结论 Ca2+促进了突触小体中神经递质的释放；异搏定、H89、Mg2+抑制了突触小体中神经递质的释放。

　　【关键词】  Ca2+； SNARE核心复合物； 神经递质释放机制； 蛋白激酶A； 突触

　　The research on the effect of Ca2+ in sciatic nerve's synaptic vesicles by detecting reactions of gastrocnemius  WANG Hong*, LI Hongfang, CHEN Fang, et al.*The First School of Clinical Medicine, Lanzhou University, Lanzhou  730000, China

　　【Abstract】  Objective  To explore the molecular mechanisms underlying neurotransmitter releasing from synaptic vesicles and confirm the exact effect in the process by proposing relative assumptions molecular mechanisms. Methods  By using the verapamil (the antagonist against Ca2+ ion channel) and H89 (the antagonist against PKA) to work selectively on the toads' isolated sciatic nerve, we could confirm the assumption in the consequence of observations on how much the muscle shrink after being stimulated. Results  The amplitude of Ca2+ group's shrinkage curve was larger than the control group's（P<0.05）; The amplitude of the verapamil group is smaller than the one of control group's (P<0.05). The amplitude of the H89 group was smaller than that of the control group (P<0.05).The amplitude of the Mg2+ group was smaller than that of the control group (P<0.05). Conclusion  Ca2+ can stimulate neurotransmitter to release from synaptic vesicles. In the process of releasing, verapamil,H89 and Mg2+ play negative roles which inhibit neurotransmitter releasing.

    【Key words】  Ca2+；SNARE Complex；The molecular mechanisms underlying neurotransmitter release；PKA；Synapse

    神经信号的传导是近几年神经生物学领域研究的热门课题，研究表明神经信号在神经突触小体处的传递以及某些细胞的分泌功能都是通过囊泡胞吐过程来完成的。这一过程涉及到许多蛋白质和脂质分子。就目前的研究发现这一过程可以分为囊泡的形成、成熟、募集、栓系和锚定、囊泡的激活、囊泡与突触前膜的融合、内含物的释放及再摄取。关于囊泡的形成、成熟、募集、栓系和锚定这几个过程已基本上达成了共识，而有关囊泡的激活以及囊泡与突触前膜的融合机制国内外研究人员观点不一，进展缓慢。但这一过程相关部分蛋白的研究已经取得了突破性的进展。基于这一点，使得我们能够在以前研究的基础之上，经过认真总结分析，提出了自己的一些大胆假设，并结合实际条件进行了验证。

    1  材料和方法

    1.1  实验动物和试剂  蟾蜍12只（成年，雌雄不拘，由兰州大学医学院实验动物中心提供，每只蟾蜍只应用1条坐骨神经腓肠肌标本）；1 mol/L的CaCl2溶液（本实验室配制）；9.5×104 mol/L H89溶液（兰州大学机能实验室惠赠）；异搏定（广东华南药业有限公司提供）；BL410（成都泰盟公司生产的生物信号采集系统）。

    1.2  坐骨神经腓肠肌标本的制备  破坏脑和脊髓，剪除躯干上部及内脏，仅留下后肢、骶骨、脊柱及由它发出的坐骨神经，剥掉全部后肢的皮肤并分离两腿。即可制作坐骨神经腓肠肌标本。

    1.3  实验设计  将坐骨神经腓肠肌标本与张力传感器连接，进入BL410系统实验记录界面，按下述的分组分别实验并做好记录。Ca2+组：先给标本一个适宜的刺激，记录正常的收缩曲线。在神经接头处加入浓度为1 mol/L的CaCl2溶液各1滴（10 μl），每5 min给予与对照组强度相同的刺激，分别记录收缩曲线的变化情况；异搏定组：记录正常的收缩曲线，在神经接头处滴加1滴（10 μl）异搏定，每5 min给予与对照组强度相同的刺激，记录收缩曲线的变化情况，至明显出现衰减波止；蛋白激酶A(PKA)的阻断剂H89组：记录正常的收缩曲线，在神经接头处滴加1滴（10 μl）H89溶液，每5 min给予与对照组强度相同的刺激，记录收缩曲线的变化情况；Mg2+组：记录正常的收缩曲线；在神经接头处加入浓度为1 mol/L的MgCl2溶液各1滴（10 μl），每5 min给予与对照组强度相同的刺激，记录收缩曲线的变化情况。注意每次加完药品之后，待收缩曲线恢复至正常之后再加下一组药品。

    1.4  统计学处理  所有实验数据用±s表示，采用两个独立样本的t检验。

    2  结果

    各实验组腓肠肌收缩曲线的振幅强度与正常组比较，见表1。表1  各组腓肠肌收缩曲线的振幅强度比较 与对照组比较，*P<0.05

    由表1可见，Ca2+组收缩曲线的振幅较正常组收缩曲线的振幅大，差异有统计学意义(P<0.05)。可以得出结论：在此Ca2+浓度下，其收缩曲线的振幅增大。可以证明Ca2+可以加强神经的兴奋性，即其可以促进神经递质的释放。

    钙通道阻滞剂异搏定组收缩曲线的振幅较正常组收缩曲线的振幅小，差异有统计学意义(P<0.05)。证明因异搏定阻断了神经突触小体上L型的Ca2+通道，使得进入神经突触小体中的Ca2+减少，腓肠肌的收缩曲线的振幅减小，进一步说明了Ca2+可以加强神经的兴奋性，可以促进神经递质的释放。

    PKA的阻断剂H89组收缩曲线的振幅较正常组收缩曲线的振幅小，差异有统计学意义(P<0.05)。可以间接验证PKA在实验假设机制中的作用，这是由于PKA可以使位于突触囊泡上的突触蛋白（synapsin）磷酸化，从而形成SNARE复合物，当用阻断剂H89使得PKA失活后，SNARE复合物就无法形成，神经递质也就无法释放或者很少释放，腓肠肌的收缩曲线的振幅减少。

    Mg2+组收缩曲线的振幅较正常组收缩曲线的振幅小(P<0.05)。Mg2+是由于竞争性的拮抗了Ca2+的作用从而抑制了突触小体中神经递质的释放。

    3  讨论

    本实验是基于宏观离体组织坐骨神经腓肠肌标本，通过测定其收缩情况，用以反映突触前膜神经递质的释放与SNARE复合物有关以及Ca2+可以增强SNARE复合物的形成等效应的结论。神经信号的传导是一个极其复杂而严密的过程。研究发现，这一过程中涉及到了很多的调控因子，包括多种蛋白质和脂质分子，其中最重要的有SNARE［1］复合物和Synaptotagmin（Syt）蛋白［16］。本实验通过研究这些相关蛋白质及阻断剂的特性和其之间的相互关系,再结合研究成果,提出了如下的假设机制，本实验也就是紧紧围绕这一假设机制展开的。

    神经突触小体处神经递质的释放包括了非Ca2+依赖式的慢反应过程和Ca2+依赖式的快反应过程，二者均是通过形成融合孔即SNARE复合物来实现的。SNARE复合物主要是由位于突触前膜的Sytaxin1［36］、SNAP25，囊泡膜上Synaptobrevin［3，4］、Snapin［24］组成。位于囊泡上Synaptobrevin蛋白的N端和囊泡上磷酸化的Snapin蛋白与突触前膜上的开放型的Sytaxin1和SNAP25结合，从而形成SNARE复合物，致使在突触前膜上形成一个融合孔，使神经递质以胞吐的形式经融合孔释放。Ca2+则是通过电压依赖式的Ca2+通道进入突触小体时诱发的Ca2+依赖性式的量子释放。其具体机制也是先在突触前膜上形成一个很小的融合孔，然后4个Ca2+与囊泡上的Syt蛋白的C2区结合，牵引着蛋白C2B与突触前膜上的磷脂酰肌醇4、5双磷酸盐结合，使Syt蛋白的C2A与突触前膜上Sytaxin蛋白结合，从而使SNARE复合物结合得更紧密，使融合孔开放更大，致使更多的递质以胞吐的方式释放到突触间隙，增强递质的效应。

    神经肌肉接头处，相当于中枢的突触小体，二者的作用机制相同，故可以依此来代替中枢突触小体进行实验。在正常生理条件的基础之上，人工在该接头处加入非毒剂量Ca2+之后，由于进入神经肌肉接头处的Ca2+增多，就会使更多的SNARE复合物与Syt蛋白在Ca2+介导下结合，形成更多融合孔使更多神经递质释放，从而使得腓肠肌收缩曲线振幅增大。相反当加入异搏定、H89后其振幅会减小。这是由于前者阻断了Ca2+通道，使得进入神经肌肉接头处的Ca2+减少，而后者主要是由于PKA可以使位于突触囊泡上的Snapin蛋白磷酸化，从而形成 SNARE复合物，当用阻断剂H89使得PKA失活后，SNARE复合物就无法形成，神经递质也就无法释放或者很少释放，腓肠肌的收缩曲线的振幅减小。而Mg2+由于竞争性地拮抗了Ca2+的作用从而抑制了突触小体中神经递质的释放。实验结果与假设结论相符合。可见本实验方案通过检测坐骨神经腓肠肌标本的收缩情况，可以宏观地反映神经递质释放的机制。

    综上所述，Ca2+促进了突触小体中神经递质的释放；异搏定、H89、Mg2+抑制了突触小体中神经递质的释放。间接验证了Ca2+、PKA在实验假设机制中的作用。随着研究的不断深入，我们将会更清楚地认识参与神经突触小体处神经递质释放的各种蛋白质和脂类，并逐步揭示神经递质释放的分子机制。本研究也将为我们理解神经递质释放的分子机制提供新的视角。

    致谢：衷心感谢兰州大学基础医学院机能实验室的张英福老师、邱小青老师、田致峰老师给予我们的支持、鼓励和帮助。

【参考文献】  1 薛箭飞,陈虹,陈乃宏. Synaptotagmin在神经递质释放过程中的作用.生理科学进展.2006,37（1）：6568.

2 Fukuda M. Molecular cloning and characterization of human, rat, and mouse synaptotagmin XV. Biochem Biophys Res Commun, 2003,306（1）：6471.

3 郑汭，周海燕，陈生弟. 神经末梢突触囊泡相关的调节蛋白.上海交通大学学报(医学版),2006, 26（7）：802806.

4 Sudhof TC. The synaptic vesicle cycle.Annu Rev Neurosci,2004,27：509547.

5 Jahn R,Sudhof TC.Membrane fusion and exocytosis.Annu Rev Biochem,1999,68（1）：863911.

6 Lao G, Scheuss V, Gerwin CM,et al.Syntaphilin：a syntaxin1 clamp that controls SNARE assembly.Neuron, 2000,25(1)：191201.