缓激肽通过抑制钙离子/钙调神经磷酸酶信号通路缓解机械刺激引起的大鼠心肌细胞肥大
发表时间：2015-01-23 浏览次数：1289次
机械刺激是导致心肌肥厚的重要危险因素之一.心肌肥厚是缺血性心脏病、心律失常和心原性碎死的独立危险因素,阻止心肌肥厚的发展有利于降低心血管事件的发生率和致死率,多种神经体液因子参与了机械负荷导致的心肌肥厚i压力超负荷可激活血管紧张素n1型受体(AT1受体)、上调钙调神经磷酸酶(CaN)的磷酸化水平,从而引起心肌细胞肥大n.a.研究表明缓激肤具有降低血压、改善心功能和降低远期心脏事件的作用,但对心脏保护尤其是对机械刺激导致心肌肥厚的机制尚不明确.本研究通过观察缓激肤抑制机械刺激诱导的心肌细胞肥大的情况来探讨其可能的作用机制,以期为其临床防治心肌肥厚提供理论依据. 材料与方法 1.实验动物与材料:出生后1一2d的SpragueDawley(SD)大鼠乳鼠,由华中科技大学实验动物中心提供.兔源单抗克隆抗小鼠CaN抗体购自美国CST公司,抗AT1受体抗体购自美国SantaCruz公司,抗血.管紧张素转换酶(ACE)抗体购自美国abeam公司,HRP标记羊抗兔二抗购自美[%lSantaCruz公司.实时(realtime)PCR试剂盒购自日本TakaRa公司.实时PCR引物由上海生工合成胰酶,DMEM低糖培养基、胎牛血清均购自美国Invitrogen公司.BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术公司.缓激肤以及其他生化试剂均购自美国Sigma-Al<lricl,公司. 2.心肌细胞的分离与培养:出生后1一2<l的SD大鼠乳鼠,75%酒精全身消毒,取出其心脏,预冷无菌的PBS缓冲液(pH值为7.4)洗十净残血后放入无血清DMEM培养液的平皿中,迅速剪成大块反复冲洗直至PBS颜色变淡.用预先灭菌的眼科剪剪碎心脏,转移至100ml内置搅拌子的小锥形瓶,加人10ml0.125%胰酶37℃水浴消化8min,吸取上清,以1500转/mii:离心5min.弃上清,将沉淀物加人到含10%胎牛血清的DMEM低糖培养液,重复数次.200目网筛过滤消化得到的细胞,除去未消化彻底的小组织块,将细胞接种于培养皿,2一3h后吸取上清,计数后按106/ml细胞密度接种于特制硅胶皿,置于5%C0,培养箱中培养待用. 3.实验分组及其干预:心肌细胞在硅胶皿中培养48一72h后,换无血清DMEM培养基,编号后随机分为3组:(1)对照组:每皿加人2ml等量的无血清细胞培养液.(2)机械刺激组:牵张硅胶皿牵张120%30min后收获细胞.(3)机械刺激+缓激肤组:加入终浓度为1x10-8mol/L的缓激肤24h后,再牵张120%作用30min后收获细胞.每组3个复孔,实验至少重复3次.在机械刺激诱导的心肌细胞肥大模型中,以特定长度的牵张板固定硅胶皿两端并拉伸延长至硅胶1117.长度的!20%,持续牵张刺激30min后立即收集细胞提取总蛋白,进行下一步的免疫印迹分析. 4.心肌细胞表面积测定:免疫荧光法染色心肌细胞.-MHC蛋白,激光共聚焦成像后,按照图像分析软件Imagepro-plus5.0使用说明分析心肌细胞表面积. 5.心肌蛋白合成率测定:迅速消化收集细胞后提取总蛋白,并以锥虫蓝染色计数活细胞,用10%牛血清培养基调整心肌细胞至5x105/ml,接种于12孔板,在加人终浓度为!x10-Rmol/L的缓激肤24h后,加人37kBq5H一亮氨酸.72h后用预冷的PBS洗涤2遍,加人10%氯醋酸1m1,4℃放置60min以沉淀蛋白.收集沉淀物,95%乙醇洗涤3遍,加人0.15mol/L的NaOH20p.,1重悬后收集到玻璃纤维滤膜上.烘干滤膜,放人闪烁瓶中,加人闪烁液3ml.用LS-6500液体闪烁计数仪测定掺入量.掺人量反映心肌细胞蛋白合成速率. 6.实时PCR检测心房利钠肤(ANP)、肌浆网Ca''-ATP酶(SERCA2)的mRNA表达:各皿细胞接受相应处理后,以预冷PBS清洗残留培养基,将心肌细胞从硅胶皿中刮下,转移至蛋白裂解液中裂解细胞.用TRIzoI一步法提取心肌组织中总RNA并测定其纯度和含量.根据GenBank提供的基因序列使用Primer5.0设计心肌细胞肥大基因ANP和SERCA2引物,以三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为参照(表1). 反应循环设置:第一步95℃变性,30s;第二步95℃变性,5s,40个循环,60℃复性,30s,75℃延伸,共计38个循环进行扩增;第三步:55℃一95℃融解曲线,80个重复,做融合曲线.Livak法进行肥大基因相对定量,以GAPDH作为参照基因所有的realtimePCR反应至少重复3次7.Westernblot检测心肌细胞AT1受体、CaN和ACE的蛋白表达:BCA蛋白定量试剂盒测定收集到的心肌细胞蛋白浓度.取20},g蛋白跑SDS聚丙烯酞胺凝胶后,半干转至PVDF膜上,一抗孵育:抗CaN一抗(稀释度1:1000),抗ACE一抗(稀释度1:1000),抗ATl受体一抗(稀释度1:1000),抗GAPDH(浓度1:10000,上海康成).室温孵育1-2h,TBST溶液洗膜.孵育二抗(浓度为1:1000),置于室温1h.根据ECL试剂盒说明书操作发光自显影,拍照并用随机软件分析条带光密度. 8.统计学分析:采用SPSS15.0统计软件进行统计学分析.实验结果均以x士、表示.不同组间比较采用方差分析.以P<0.O5为差异有统计学意义. 结果 1.各组大鼠心肌细胞表面积检测结果(图1):持续牵张30min后机械刺激组和机械刺激十缓激肤组心肌细胞表面积均显著大于对照组「(9731103)和(603士74)林m}分别比(312士29)林mz,P分别<0.O1和0.05],但机械刺激+缓激肤组显著小于机械刺激组(P<0.05). 2.各组大鼠心肌细胞蛋白合成率检测结果:机 械刺激组和机械刺激+缓激肤组大鼠心肌细胞蛋白合成率均显著高于对照组,分别为对照组的(4.5士3.7)和(3.0士1.9)倍(P分别<0.O1和0.05),其中机械刺激+缓激肤组又显著低于机械刺激组(P<0.05). 3.各组大鼠心肌细胞肥厚相关基因ANP,SERCA2mRNA表达的检测结果:机械刺激大鼠心肌细胞30min后,实时PCR检测结果显示ANP,SERCA2mRNA重排,机械刺激组和机械刺激+缓激肤组大鼠心肌细胞ANPmRNA表达水平均显著高于对照组,分别为对照组的(4.1士0.4)和(2.3士0.2)倍(P分别<0.O1和0.05),而SERCA2mRNA表达水平则均显著低于对照组,分别为对照组的(0.52士0.05)和(0.79土0.08)倍(P分别<0.O1和0.05).其中机械刺激+缓激肤组大鼠心肌细胞ANPmRNA表达水平又显著低于机械刺激组,而SERCA2mRNA表达水平显著高于机械刺激组(P均<0.05). 4.各组大鼠心肌细胞ACE蛋白表达水平的检测结果(图2):机械刺激30min后,机械刺激组和机械刺激+缓激肤组大鼠心肌细胞ACE蛋白表达水平均显著高于对照组,分别对照组的(3.210.4)和(2.7士0.4)倍(尸均<0.05),且机械刺激组与机械刺激+缓激肤组组间比较差异无统计学意义(P>0.O5). 5.各组大鼠心肌细胞ATl受体蛋白表达水平的检测结果(图3):机械刺激组和机械刺激+缓激肤组大鼠心肌细胞AT1受体蛋白表达水平均显著高于对照组,分另}J为对照组的(3.7土0.3)和((2.1士0.2}倍}P分别<0.Ol和0.OS),其中机械刺激+缓激肤组又显著低于机械刺激组(p<0.05). 6.各组大鼠心肌细胞Ca_1磷酸化的检测结果(I'}l4>:机械刺激组和机械刺激+缓激肤组大鼠心肌细胞磷酸化CaN表达水平均{}、工著高于对照组,分别为对照组的(6.4士0.6)和(3.6士0.3)倍(P分别<0.O1和0.O5),其中机械刺激+缓激肤组又{u'.著低于机械刺激组(P<0.O5). 讨论 病理性心月几肥厚是导致各种心脏事件的重要危吓训川素如轻理化了}物学起的亡肌肥厚成为临床i台的新靶标yin.管紧张素转换酶抑制齐弓(ACEI是治疗心力衰竭的基石性药物,有研究表明其除了抑制Ang1l合成外,还可提高体内缓激肤水平,从}fu增强了缓激肤的心脏保护作用,’2但缓激肤的心肌机制尚不明确本研究通过体外模拟仄力超负菏心肌损伤模型发现缓激肤可有效抑制机械刺激诱发的心肌细胞肥大反应,包括抑制心肌细胞表面积增加、肥大基因的重新表达以及蛋自合成率的卜升,并初步探讨了相应的细胞内信号传导机制激肚释放酶一激肤系统(kallikreinkininseatem,KKS)在心血管系统中发挥着重要的调节功能‘,新近研究表明KKS可以士曾加心肌梗死患者的冠状动脉血流、减小梗死面积、改善心室重构,从而改善心功能’3缓激肤是KKS中重要的扩血管物质之一,可通过直接扩张血管、对抗血管紧张索、促进一氧化氮等内源性舒血管物质的合成舒张血管缓激肤的生理作用主要是通过缓激肤日2受体(1},二、lvkininreceptor(3-,RI)1<R(3=)介导的研究发现KKS}sJ通过RDKR(3=介导而缓解压力超负荷导致的心肌肥厚’"压力超负菏是心脏最重要的机械刺激力一式,在压力超负荷性左心室肥厚的发生发展过程中,心脏局部的肾素-Ifll.竹紧张素一醛固酮系统(resinan}iontFnsinalcloatercmes1}stPm,RAAS)的过度激活起促进作用. 而R_1:W的激活又是由压力超负荷这一机械刺激所致气当爪力超负荷持续作川于心朋,心BIi会明显变大单个心肌细胞体积也明'u".变大本研究发现机械刺激日丁以引起心肌细胞表lf}l积增大、总蛋自合成增加,_巨肥厚相关基因的表达重排Ca-一/CaN信号通路是介导压力超负荷所致心肌肥厚和心肌损伤的核心信号传导通路,尤其在:}'1'1受体过度激活导致心肌肥厚的过程中起着决定性作川,是}T1受体下游信号传导网络中的核心分子之一,本研究也证实〔在压力超负荷所致的自肌肥厚中磷酸化水平其机制,l一能与缓激肤犷印制机械刺激听汁致的,受体表达升高有关起初我们拍测缓激肤可能通过抑制}(:I:表达从IfII抑制11受体的活性,所以我们检测犷缓激肤十预前后机械刺激讨1CF表达的影响,结果提小缓激肤对机械刺激导致的ACF表达上调影响不明显缓激肤是如何作用于}T1受体的机制尚不明确总、之,本研究进一步证实CaV是机械刺激导致的白肌细胞肥大过程,重要的心肌肥厚信号传递分子缓激肤抑制机械刺激导致的心肌细胞肥大可能是因其抑制了}T1受体活性井下调了(Ca1}的磷酸化水平,而i亥作用不是通过抑制}CF表达途径实现的至于缓激肤是否通过RDhRpZ介导来影响A'll受体的表达,进而抑制心肌细胞内Cal活性,尚有待进一步研究. 参考文献 1.Komuro I. 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