过氧化物酶体增殖物激活受体基因单核苷酸多态性与动脉僵硬度的关系

大量研究表明,无论是老年人群还是中青年人群,无论是患有心血管疾病人群还是健康人群,动脉僵硬度都能很好地预测冠心病、卒中等心脑血管事件,是心脑血管疾病独立预测因子,已被欧洲高血压指南列为常规检测项目.年龄、血压水平和性别等重要影响因素只能部分解释动脉僵硬度变异性,提示可能有遗传的影响.    大量研究表明过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisomeproliferator-activatedreceptor,PPAR)影响血糖、血脂代谢,并且有抗炎、抗增殖等作用,PPAR基因部分单核昔酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms,SNP)位点不仅影响糖尿病的发生、发展,还能直接影响动脉粥样硬化的发生、发展,但PPAR基因是否影响动脉僵硬度还未见报道.本研究旨在通过检测PPAR及PPAR协同子等候选基因内的部分SNP位点,观察其与动脉僵硬度的关系.    资料与方法    1.对象:在2007年至2009年在北京地区进行的旨在早期发现心血管疾病的流行病学调查人群基础上[9],本研究筛选出完成了颈股段脉搏波传导速度(carotid-femoralPWV,cfPWV)测定,并留取了血液样本的50岁以上汉族居民1545例.恶性肿瘤、精神病等患者除外.所有参与者签署知情同意书.    由于基因分型时所有位点均成功的有1374例,为便于同步分析心血管危险因素和遗传因素对动脉僵硬度的影响,本研究舍去了171例分型不够理想的参与者.    2.动脉僵硬度的测定:本研究使用法国Colson和LesLilas公司生产的Complior系统,按照标准测量方法检测受试者cfPWV,以cfPWV作为金标准判断动脉僵硬度.按2007年欧洲高血压防治指南,将cfPWV,12m/s定为动脉僵硬度增高组,共530例,其中女性275例(占51.9%);cfPWV<12m/s为动脉僵硬度正常组,共844例,其中女性511例(占60.5%).检测时,检测人员不知道被检测人员心血管危险因素等情况.    3.主要试剂和仪器:TaqMan基因分型预混液(AppliedBiosystems公司,美国),基因分型探针(上海基康生物技术有限公司).ABI7900HT荧光实时定量PCR仪(AppliedBiosystems公司,美国).    4.DNA提取:按已建立的方法以Wizard⑧基因组DNA提取试剂盒(Promega公司,美国)从冻存的血凝块内提取全基因组DNA,纯化、定量后置于一70℃冰箱中保存备用.    5.引物设计与合成:根据基因的目标序列和所选择的多态性位点,利用SequenomMassARRAY)AssayDesign3.1软件(Sequenom公司,美国)设计PCR特异性扩增引物和探针序列,由上海基康生物技术有限公司负责引物和探针设计、合成(表1,2).    6.基因分型分析:向384孔板内加人PCR扩增体系及检测探针使反应物的终浓度如下:lxTaqMan基因分型预混液,各0.45mmol/L的PCR引物,0.25mmol/L的TaqManFam探针,0.25mmol/L的TaqManHex探针.总反应体系为5.0闪.提取纯化后的基因组DNA样品定量稀释至10ng/}1,按设计顺序每孔加2},1基因组DNAoPCR反应条件为:50℃2min,95℃10min,然后95℃15s,60℃60s,循环40次.    7.统计学分析:正态分布计量资料用,.x士、表示,组间比较用独立样本,检验;偏态分布计量资料用中位数和四分位数表示,组间比较用Mann-Whitneyt7检验计数资料用例数和百分率表T,组间比较用f检验.SNP分析使用JAVA版单体型关联研究测试(testinghaplotypeeffectsinassociationstudies,THESIAS)程序THESIA程序源于随机期望最大化(stochasticexpectation-maximization,SEM)算法,优于标准EM算法;Hardy-Weinherg平衡以标准X}拟合度检验法计算’3其他数据用SPSS13.0统计软件进行统计学分析双侧检验,P<0.O5为差异有统计学意义.    结果    1.研究人群的一般特征:动脉僵硬度增高组(efPWV}12m/s)中有293例(55.30h)有高t(Il压病史,115例(21.7%)有糖尿病史,女性275例(51.9%);而动脉僵硬度正常组有257例有高I(11压病史(30.5),93例(11.0%)有糖尿病,女性511例(60.5%),两组间在年龄、男性、吸烟、高血压、糖尿病等心血,管危险因素上差异有统计学意义(表3).    2.基因型频率及Hardy-Weinherg平衡:PPARy协同子基因rs8192678,PPARB基因rs1053049,PPAI}.基因:s1800234等位l氛各自的等位基因频率、基因型频率见表4ors8192678,rs1053049两个位点在调杳人群中的分布符合Hardy-Weinberg平衡,但:s1800234不符合Hardy-Weinberg平衡.    3.SNP位点与动脉僵硬度的关系:PPARy协同子基(}Irs8192678,PPARB基因rs1053049,PPARa基因rsl800234等3个位点其基因型在动脉僵硬度止常和增高组中分布的差异无统计学意义(表5).    4.单体型的构建与动脉僵硬度的关系:由PPARy协同子基因rs8192678,PPARB基ICIrs1053049,PPAR.基[}}]rs1800234组成的单体型与动脉f+}硬度无明确关系(表6).    讨论    在本研究中仅发现年龄、男性、吸烟、高血压、糖尿病、同型半眺氨酸等心血管危险因素在动脉僵硬度增高组明显聚集,并未发现PPAR及PPAR协同子基因上的SNP对动脉僵硬度有直接的影响和动脉粥样硬化一样,动脉僵硬度受多种因素的影响各种心血管危险因素可通过损伤血管内皮导致动脉内中膜钙化斑块形成、弹力纤维减少、胶原纤维增加、血管平滑肌增生和肥厚,从而一导致血管僵硬度增高但年龄、血压等传统心血管危险因素只能部分解释动脉僵硬度变异,提不动脉僵硬度可能还受遗传因素影响,Tarnoki等〔is的研究也证实了这一点大量研究表明PPAR影响血糖、血脂代谢,并且有抗炎、抗增殖等作用,因此我们推测PPAR基因可能对动脉僵硬度有影响.另有研究发现PPAR基因能直接影响动脉粥样硬化的发生和发展,但PPAR基因是否影响动脉僵硬度未见报道在本研究中未发现PPAR及PPAR协同子基因上的SNP对动脉僵硬度有直接的影响.尽管如此,遗传因素对动脉僵硬度有确切影响是不争的事实,一二候选基因研究、全基因组研究均发现位于肾素一血管紧张素一醛固酮系统、基质金属蛋白酶、内皮素及与炎症相关的基因上多个SNP位点与动脉僵硬度有密切关系[n7,较普遍的共识是遗传因素对动脉僵硬度变异的影响为20%一60%.由于本研究是阴性结果,不能进一步分析环境和遗传因素对动脉僵硬度的交互作用.    本研究未发现阳性结果,其原因可能是多方面的.首先,所研究SNP位点可能并不是中国汉族人PPAR及PPAR协同子基因内真正影响其功能的关键位点.本研究所选取的位点rs1800234位于PPAR.亚单位,在外显子6上,由于CST变异导致227号密码子处撷氨酸替代丙氨酸(V227A),为非同义变异,有较高的潜在研究价值.但是,多态性位点的功能机制很复杂,在不同人种间的分布有差别,同一基因内功能性位点可能也有差别.有很多研究发现那些处于非编码区的SNP反而与某种疾病有很紧密的联系〔19],至今不能准确阐明其机制.这些不确定性,导致研究候选基因时,特别是研究候选基因内取较少的位点时,容易出现阴性结果.    其次,对心血管危险因素有影响的基因未必直接影响心血管疾病.动脉粥样硬化性疾病被认为是高血压、高脂血症、吸烟等各种危险因素导致的一种炎性疾病[20].但是,被寄予厚望的与炎症因子相关的候选基因高敏C反应蛋白基因,在大样本、严谨的研究中也只发现其仅对高敏C反应蛋白浓度有影响,而对心血管疾病没有直接的影响.一些针对动脉硬化的研究也发现,部分参与动脉粥样硬化的炎症因子也参与了动脉硬化,但这些与炎症因子相关的基因是否参与了动脉硬化还需要进一步研究[23].    另外,虽然大量的流行病学研究提示遗传因素在心血管疾病的发生和发展中发挥了非常重要的作用「24],但除2007年用全基因组筛查的方法发现的rs10757274,rs2383206,rs2383207,rs10757278等少数几个SNP位点在十几个国家得到了验证汇,大部分基因研究的结果常不能被重复}.究其原因,既有单个研究结果的假阳(阴)性,或是真实的差异造成,更重要的是基因对疾病易感性影响的复杂性.单个研究的假阳(阴)性结果可能由单个研究的样本量不足、人群分层、基因型或表型的错分以及不适当的统计学分析方法等引起,而真实的差异多是由易感基因频率不同,与疾病关联特征不同,或是基因与环境间的复杂交互作用导致.    由于本研究为针对候选基因的研究,能选取的SNP位点数量有限,又没有对PPAR及PPAR协同子进行全基因序列检测,势必会漏掉一些SNP位点在这些没有检测的SNP位点中,是否有对动脉僵硬度有明显影响的SNP位点,本研究不能回答.若使用全基因组测序的方法,可能会有阳性发现,但所需经费会明显增加.另外,本研究为横断面研究,结论尚需临床前瞻性研究进一步证实.    综上所述,本研究发现动脉僵硬度增高组与正常组相比,心血管危险因素明显增多,但并未发现PPAR及PPAR协同子基因上的SNP对动脉僵硬度有直接的影响.    参考文献    1.Vlachopoulos C,Aznaouridis K,Stefanadis C. 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