外源性全反视黄酸对出生后豚鼠锥细胞视蛋白表达和方向性的影响

作者：李瑾    作者单位：复旦大学附属眼耳鼻喉科医院 眼科，上海 200031  【摘要】    观察一定浓度的外源性全反视黄酸（all-trans retinoic acid，ATRA）对豚鼠锥细胞视蛋白表达和方向性的影响。方法 出生1周豚鼠28只，随机分为ATRA组（n=14）和正常对照组(n=14)。ATRA组随机选取一眼于暗红光下球周注射0.4 mg/ml浓度ATRA 0.05 ml，对照组随机选择一眼球周注射稀释ATRA用的相应浓度二甲基亚砜(0.001 ml/L)和注射用水共0.05 ml。4周后取眼球，行免疫组织化学方法和RT-PCR技术观察M-视蛋白和S-视蛋白的分布和表达密度，并检测两种视蛋白的mRNA表达，方向性以Leica光学显微镜进行观察。结果 ATRA处理眼S-视蛋白的表达密度：下方为（499.4±147.6）mm-2，上方为（87.8±44.9）mm-2，中央为（968.4±210.2）mm-2；正常组S-视蛋白的表达密度：下方为（805.0±203.3）mm-2，上方为（100.0±57.7）mm-2；中央为（1637.2±314.1）mm-2。ATRA处理眼M-视蛋白的表达密度：上方为（1326.1±267.0）mm-2，中央为（2984.0±613.4）mm-2，下方为（232.9±173.6）mm-2；正常组M-视蛋白的表达密度：上方为（946.2±388.5）mm-2，中央为（1666.7±137.8）mm-2，下方为（175.0±100.9）mm-2。0.4 mg/ml浓度的ATRA 0.05 ml局部球周注射后使豚鼠视网膜的M-视蛋白的表达密度较正常对 照组增加，S-视蛋白的表达密度减少。RT-PCR检测示M-视蛋白的相对光密度值分别为1.25±0.11(ATRA处理眼)和0.51±0.10(对照眼)，S-视蛋白的相对光密度值分别为0.61±0.09(ATRA处理眼)和1.25±0.06(对照眼)。ATRA处理眼与对照眼相比，M-视蛋白的mRNA表达增加，S-视蛋白的mRNA表达下降，两因素方差分析示两组差异均有统计学意义（P<0.05）。铺片的免疫组化结果经光学显微镜观察提示，正常豚鼠视网膜M-视蛋白有一较小的偏斜角，朝向较垂直。ATRA作用后可见M-视蛋白偏斜角明显，朝向水平位，而且排列极有规律。对S-视蛋白的方向性没有影响。结论 豚鼠锥细胞视蛋白的表达和方向性在出生后仍具有可塑性。0.4 mg/ml的ATRA球周局部作用后增加M-视蛋白的mRNA表达，减少S-视蛋白的mRNA表达；使豚鼠视网膜的M-视蛋白的表达密度增加，S-视蛋白的表达密度减少；中波敏感性锥细胞不仅内节具有方向性，其外节视蛋白也具有方向性。ATRA可使M-视蛋白的方向性更为有规律，但对S-视蛋白的方向性没有影响作用。

【关键词】  全反视黄酸 锥细胞 视蛋白 方向性 豚鼠

 众所周知，感光细胞具有光波引导的特点，这可通过瞳孔缘的入射光线的史泰-克劳福德效应 (Stiles-Crawford effect，SCE)得到证实[1]。史泰-克劳福德效应(Stiles-Crawford effect，SCE)是光感受器的一种光学特性，它指的是锥细胞的方向敏感性。锥细胞的内节是光波引导精致排列的，它在人类中首次被发现[1]，光感受器的向光性决定了它朝向瞳孔方向的特性。

    全反视黄酸(all-trans retinoic acid，ATRA)是类维生素A的一种，在眼的发育中具有重要作用。在组织培养中，它是胚胎光感受器的存活和分化所必需的[2]。已有研究发现，外源性ATRA会使斑马鱼胚胎表达红波敏感性视蛋白的感光细胞增加，却减少表达蓝光或紫外线敏感视蛋白的感光细胞，提示其在光感受器发育中具靶向性作用[3]。但ATRA是否会影响出生后的动物的锥视蛋白的表达仍不清楚。

    1  对象和方法

    1.1  实验对象  出生1周英国短毛有色豚鼠28只，分为ATRA处理组（n=14）和正常对照组(n=14)，在正常的自然亮/暗的周期光线环境中饲养。ATRA处理眼随机选择一眼（n=14）在暗光条件下球周注射0.4 mg/ml浓度的ATRA 0.05 ml，看到眼球略前突为注射成功。对照组随机选择一眼(n=14)球周注射稀释ATRA用的二甲基亚砜（0.001 ml/L，DMSO）0.05 ml（以注射用水稀释）。所有的实验均于早上10时进行。

 1.2  实验方法

    1.2.1  免疫组化法观察视蛋白的分布和表达密度

    4周后ARTA处理眼（n=8）和对照眼(n=8)行4%多聚甲醛心脏灌注，在眼球的背侧做标记以确定方位。取出眼球，于4%多聚甲醛中固定2 h后，以0.01M PBS洗涤。取神经视网膜层，用0.01M PBS洗涤3次，放射状切开后加入1：200兔抗鼠红/绿锥细胞视蛋白（L/M-cone opsin）或蓝锥细胞(S-cone opsin) 一抗，置37°C 1 h后于4°C冰箱敷育过夜。0.01 M  PBS洗涤3次后加入二抗（1：100 CY3羊抗兔带488荧光抗体），37°C 1 h后以0.01 M PBS洗涤3次，光感受器面朝上铺片。以Leica光学显微镜观察豚鼠视网膜腹侧和背侧及中央区的视锥细胞视蛋白的表达以及视蛋白的方向性。

    1.2.2  RT-PCR技术检测神经视网膜M-视蛋白和S-视蛋白的mRNA含量  4周后，ARTA处理眼（n=6）和对照眼(n=6)给予致死量苯巴比妥钠处死动物，将眼球取出，于冰块上剪除角膜，清除虹膜、晶状体、玻璃体，将眼球放射状剪6刀，后极部仍相连。取出神经视网膜，迅速放入液氮中冷冻后转入-80°C冰箱保存待测[4]。

    1.3  统计学方法  数据采用SPSS统计软件进行方差分析。

    2  结果

    2.1  锥细胞视蛋白表达的空间密度  豚鼠S-视蛋白和M-视蛋白的表达密度见表1。ATRA处理眼与对照眼相比，差异有统计学意义（P<0.05）。

    2.2  M-视蛋白和S-视蛋白mRNA的RT-PCR结果  将内参照β-actin表达水平设在相同的条件下进行电泳条带分析，RT-PCR所显示的是M-视蛋白和S-视蛋白的核酸转录水平的变化，反映蛋白的生成能力。M-视蛋白和S-视蛋白mRNA的RT-PCR结果见表2。

     ATRA处理眼与对照眼相比，M-视蛋白的mRNA表达增加，S-视蛋白的mRNA表达减少，两因素方差分析示，两组差异均有统计学意义（P均<0.05）。

    2.3  锥细胞视蛋白的方向性  免疫组化结果经Leica光学显微镜观察，正常豚鼠视网膜M-视蛋白有一较小的偏斜角，朝向较垂直（见图1、图3、图5）。 ATRA作用后可见M-视蛋白偏斜角明显，而且排列极有规律，朝向水平位（见图2、图4、图6），对S-视蛋白的方向没有影响。该实验结果重复性良好。

    3  讨论

     大鼠视网膜视杆细胞和视锥细胞在生后10 d开始才有光反应，但豚鼠相关方面少见报道。因此，我们选择1周龄的豚鼠，希望避免刚出生豚鼠的低存活率，而又在其可能的光反应期之前。

    ATRA是一种脂溶性的制剂。球周注射脂溶性的物质的药物可通过筋膜下的浸润直接经巩膜吸收至脉络膜和视网膜。ATRA对于锥细胞发育有信号靶向作用[5]。ATRA是脊椎动物感光细胞发育的重要的信号物质，它帮助视网膜发育腹背侧轴形成。已有研究证实，外源性ATRA作用于斑马鱼胚胎后会增加L/M视蛋白的表达，减少了S视蛋白的表达[3]，他们认为ATRA并不影响它们的存活，只是影响其视蛋白的转录。

    本研究结果提示，外源性ATRA球旁注射可影响出生后1周豚鼠的S-视蛋白和M-视蛋白的表达和方向性。本研究发现，外源性的ATRA使M-视蛋白在豚鼠神经视网膜三个区域的表达密度均增加，而 S-视蛋白的表达均减少（P<0.05），与本研究组前期研究形觉剥夺引起的豚鼠锥视蛋白的改变极为相 似[4]。同时本研究还发现，在这些条件干预后，两种视蛋白的密度分布也出现与形觉剥夺相似的改变。在正常的豚鼠视网膜中，M-视蛋白的表达在中心区较高，其他地方密度就低很多，但在条件干预后，它的表达在各分区密度相差缩小。ATRA作用后M-视蛋白有一个分布规律化和极性化的趋向，说明   ATRA在锥细胞的发育过程中具有某种导向作用，但这种作用的意义目前尚不清楚。

 在出生后的豚鼠有些锥细胞同时表达S+L/M视蛋白[6]。以前认为这些锥细胞对于一个种属的意义可能在于拓宽了锥细胞起作用的范围。但进一步的锥细胞的研究发现[7]， S+L/M 锥细胞是出生后可转化视蛋白表达的锥细胞，这就为出生后的哺乳动物的锥细胞的可塑性创造了可能性。

    ATRA对视蛋白表达的影响提示，ATRA可能对锥细胞发育过程有较重要的影响，异常的视觉环境可能会继发地引起捕获光线的光子的能量不同，使视觉的视色素循环中的产物浓度不同，例如视黄醛的各种构型的浓度、视黄酸的浓度等，干扰了正常的视觉发育过程所需的锥细胞的转化比率。这些事件的改变可能产生S+L/M锥细胞向不同类型的锥细胞转化的比例不同。

    本研究还发现， 锥细胞外节视蛋白同以前发现的内节一样具有方向性。也许对于锥细胞而言，外节的方向性可能是非常重要的，因为光的捕获主要是通过视蛋白。本研究还发现， ATRA作用后使M-视蛋白的方向性更为有规律，朝向水平位，对S-视蛋白的方向没有影响，实验重复性良好。

    锥细胞的光波引导性的特点使感光细胞可以较旁边的成角度的光线更好地捕获直接的光照射，有利于成像。瞳孔中央进入的光线较旁轴光线成像更锐利些。这种进化策略忽略了旁轴光线形成的朦像，有助于中轴光形成的锐利的高对比度的像。ATRA作用后M-视蛋白的方向性改变目前尚不知，对视觉成像的影响如何，仍需进一步的研究。

    视锥细胞的内节方向性具可塑性。视网膜光感受器并不是和眼球表面垂直的，而是朝向瞳孔中央的一点，因此人们设想光感受器的方向会受入射光线的影响从而自我调整。Enoch等[8]报道1例视网膜脱离患者在巩膜环扎术后光感受器的方向受到了干扰，但几个月后就恢复了。另1例在童年瞳孔外伤移位后的研究发现，黄斑和黄斑周围的光感受器的方向变得朝向偏位瞳孔，幼年时瞳孔偏心会引起SCE光导性的改变[9]。中、高度近视中光感受器的方向改变可能是眼轴增加对光感受器的跨视网膜产生牵拉作用。在体锥视蛋白方向性有许多测量方法，但离体除了观察其方向外尚未有合适的测量方法。

    本研究发现，出生后1周豚鼠M-视锥蛋白方向性同样具有可塑性。从感光结构而言，主要是视蛋白捕获光子，因此，视蛋白的方向性可能在SCE中起了重要作用。视觉环境有可能是通过全反视黄酸介导途径来起到对锥细胞方向性的光引导排列的，这有可能可用于研究屈光不正。近视、散光、远视产生的在视网膜投影的光线方向有异于正常，在幼时可能会导致锥细胞的方向性改变，从而产生朦像引发弱视，斜视中的偏心注视可能也会导致SCE的改变导致弱视。

    综上所述，全反视黄酸是影响出生后豚鼠锥细胞光感受器视蛋白表达和方向性的重要物质，它可能通过影响其方向和表达量对视觉产生影响。

【参考文献】  [1] Stiles WS， Crawford BH. The luminous efficiency of rays entering the eye pupil at different points[J]. Biol Sci，1933，112：428-450.

[2] Kelley MW， Turner JK， Reh TA. Retinoic acid promotes differentiation of photoreceptors in vitro[J]. Development，1994，120(8)：2091-2102.

[3] Prabhudesai SN， Cameron DA， Stenkamp DL. Targeted effects of retinoic acid signaling upon photoreceptor development in zebrafish[J]. Dev Biol，2005，287(1)：157-167.

[4] 李瑾，褚仁远，胡敏，等. 形觉剥夺对豚鼠锥视蛋白表达的影响[J]. 中华眼科杂志，2007，43（3）：266-270.

[5] Melanie R， Roberts， Anita Hendrickson. Retinoid X receptor is necessary to establish the S-opsin gradient in cone photoreceptors of the developing mouse retina[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2005，46(8)：2897-2904.

[6] Parry JW， Bowmaker JK. Visual pigment coexpression in guinea pig cones：a microspectrophotometric study[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2002，43(5)：1662-1665.

[7] Courish EE， Xiao M， Yang Z， et al. The role of opsin expression and apoptosis in determination of cone types in human retina[J]. Exp Eye Res，2004，78(6)：1143-1154.

[8] Enoch JM， Van Loo JA Jr， Okun E. Realignment of photoreceptors disturbed in orientation secondary to retinal detachment[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，1973,12(11):849-853.

[9] Fitzgerald CR， Enoch JM， Birch DG， et al. Anomalous pigment epithelial photoreceptor relationships and receptor orientation[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，1980，19(8)：956-966.