人Tenon′s囊成纤维细胞的离体培养及生长特性观察

作者：陈凤华    作者单位：首都医科大学附属北京同仁医院眼科中心， 北京 100730

【摘要】  目的 离体培养人Tenon′s囊成纤维细胞，观察其生长特性。方法 将人Tenon′s 囊成纤维细胞进行离体培养及生长抑制实验，采用含10%胎牛血清的DMEM培养基，细胞计数法及MTT法描述细胞生长曲线。并通过免疫组织化学法对细胞进行鉴定。结果 人Tenon′s 囊成纤维细胞离体培养48?h至7?d处于对数生长期。细胞角蛋白染色阴性，波蛋白染色阳性。结论 人Tenon′s囊成纤维细胞在体外易于生长，是细胞离体实验研究的良好材料。

【关键词】  Tenon′s囊 成纤维细胞 细胞培养 青光眼滤过手术

   To culture the human Tenon′s capsule fibroblast cells in vitro and to observe its growth property. Methods  Human tenon′s capsule fibroblast cells were grown in  DMEM medium containing 10% fetal bovine serum at 370C, 5%CO2, and the medium was changed every third day. Cell proliferation was assayed by counting the cell number and the cell growth curve was drawn. Results  Results revealed that from 48 hours to 7 days after seeding the plate, the cells were in the logarithm growth period. The cells were negatively stained with Cytokeratin and positively with Vimentin. Conclusion  Human Tenon′s capsule fibroblast cells are easy to culture and are convenient for cell research in vitro.

    Key words:  Tenon′s capsule; Fibroblasts; Cell culture; Glaucoma filtering operation

　　1  资料与方法

    1.1  标本来源  人眼标本取自我院眼库，于死后6?h内无菌取材，成年男、女各1例，取材后放入冰壶保存，经抗菌处理后1?h内接种。

    1.2  主要试剂和仪器  DMEM培养基(美国,GibcoBRL)，胰蛋白酶，胎牛血清(美国,Hyclone)，鼠抗人角蛋白单克隆抗体、鼠抗人波蛋白单克隆抗体（北京，中山生物技术公司）， MTT（美国，Sigma）。 倒置相差显微镜（日本，Olympus），CO2细胞培养箱（德国，Heraeus），酶标仪（美国，BIORAD，Model450）。

    1.3  方法

    1.3.1  人Tenon′s囊成纤维细胞的原代培养  将无菌取材的Tenon′s囊标本放于4?℃冰盒内带回实验室，浸泡于生理盐水中（内含妥布霉素320?U/mL）40?min，用无菌显微手术剪在超净台内将其剪成2?mm 2大小组织块，接种于培养瓶中，倒置培养瓶，使组织块倒贴于上方瓶底，同时向瓶内小心加入少量DMEM培养基(含10%胎牛血清，100?U/mL青霉素，100?U/mL链霉素)，使培养基既不与组织块接触，又可防止组织块干燥。于37?℃、5% CO2培养箱内培养约4～6?h后，组织块贴附牢固，再将培养瓶复位，使组织块浸入培养基中，继续培养。

    1.3.2  人Tenon′s囊成纤维细胞的传代培养  原代细胞培养约2周后，细胞大部分融合，用0.25%胰蛋白酶消化3～5?h，在显微镜下观察细胞收缩变圆后，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，小心吹打混匀细胞，按1∶3比例接种传代。

    1.3.3  人Tenon′s囊成纤维细胞的免疫组化观察  将生长良好的各代成纤维细胞接种于事先放好盖玻片的无菌35?mm培养皿中，生长至80%融合后，取出长有细胞的载玻片，用PBS冲洗，甲醇和丙酮（1∶1）混合液(新鲜配制)固定、免疫组化染色，DAB显色，光镜下观察并照相。

    1.3.4  离体培养成纤维细胞生长曲线的测定  ① 计数法。收集生长良好的细胞，消化后以4×104/mL及2×104/mL浓度接种于24孔板中，每孔加样1?mL,每48?h换液一次，分别于1、2、4、6、8、10、12?d，将4孔内的细胞消化下来，台盼蓝染色后，用血细胞计数板计数，取4孔内细胞计数的平均值绘制成细胞生长曲线［3］；②　MTT 法。将生长良好的细胞以4×104/mL及2×104/mL浓度接种于96孔板中，每孔100?μL，于37?℃、5% CO2培养箱内培养不同时间，每48?h换液一次，分别于1、2、4、6、8、10、12?d向4孔内加入20μL MTT溶液，37?℃、5% CO2培养箱内孵育6?h，每孔加入100?μL 20%SDS50%DMF,室温下振荡30?min，酶标仪测定各孔吸光度（OD值），最大吸收波长600?nm。将各孔细胞计数的平均值绘制成细胞生长曲线。

2  结  果

    2.1  培养人成纤维细胞的形态特征  原代培养的人Tenon′s囊成纤维细胞组织块接种后，约3天即可见细胞由组织块中游离出来，在2～3周长满融合，镜下呈紧密排列的单层长梭形贴壁细胞(图1～2)。细胞对胰酶消化敏感，传代细胞用0.25%胰酶37?℃消化3～5?min，大部分细胞即收缩变圆，易于吹打下来。传代细胞接种后4?h大部分细胞贴壁，1周长满融合(图3～4)。

    2.2  培养人成纤维细胞的免疫组化鉴定  体外培养的人Tenon′s囊成纤维细胞经免疫组化SP法染色可见角蛋白染色阴性(图5)，波蛋白染色阳性(图6)，阳性细胞胞浆内可见与细胞长轴方向一致的棕黄色束状或网状结构。染色呈阴性，胞浆内无着染物质角蛋白染色

    呈阳性，胞浆内可见棕黄色着染物质波蛋白染色

    2.3  培养细胞生长特性观察  用计数法及MTT法做的细胞生长曲线基本一致(图7～8)。由曲线可见，细胞在2～8?d处于对数生长期。

    3  讨  论

    3.1  本研究的意义  眼部的许多增殖性疾病(如青光眼滤过术后、翼状胬肉、角膜瘢痕形成等)都与效应细胞——成纤维细胞的过度增生有密切的关［4］。Tenon′s囊成纤维细胞过度增殖导致滤过口阻塞是青光眼滤过手术失败的主要原因，因此，成纤维细胞的成功培养是上述纤维增殖性疾病研究的前提和基础。人和动物的组织由于物种差异，细胞生长难易也有差别。动物组织取材方便，其组织细胞离体培养相对要容易些。但由于将来主要应用于对人类疾病的研究，如果条件许可尽量取用人的组织进行研究。有关人Tenon′s 囊成纤维细胞的培养方法已有报道，方法各有特点，深入探讨Tenon′s 囊成纤维细胞的培养方法、优化Tenon′s 囊成纤维细胞的培养方式，可为进一步抗瘢痕研究奠定基础。

    3.2  人Tenon′s囊成纤维细胞的离体生长特点及细胞鉴定  本研究发现，在细胞离体培养中，用组织块培养法培养人Tenon′s囊成纤维细胞，细胞较易于生长，不需要特殊条件，采用DMEM培养基（含10%胎牛血清）常规培养即可。多数细胞长满时呈梭形［5］。

    细胞质内的中间丝状蛋白是鉴定细胞的有用指标之一。目前发现至少有5个亚组的丝状蛋白质分布具有组织类型的特异性。如大多数组织的上皮细胞含有细胞角蛋白，间质细胞含有波形蛋白Vimentin（它是一种中等纤维成分）［6］。成纤维细胞属于间质细胞，因此细胞角蛋白染色阴性，波形蛋白染色阳性。再结合细胞生长的形态学特征，可证明是成纤维细胞。

    通过细胞生长曲线可见，传代细胞在接种后48?h至1周，细胞生长旺盛，为对数生长期，细胞实验多选在此期内进行。

    3.3  细胞生长曲线的测定  除了通过传统的细胞计数法测定细胞生长曲线外，本研究也尝试通过MTT法检测细胞的生长状态，并与细胞计数法进行了比较。MTT法检测细胞增值的原理是：细胞增殖时能量代谢活跃，能量代谢的水平与细胞合成DNA的水平基本一致。因此，测定细胞能量代谢水平可以间接反映细胞增殖的情况。活细胞特别是增殖期细胞可通过线粒体能量代谢过程中琥珀酸脱氢酶的作用使淡黄色的MTT分解产生蓝色结晶状甲瓒沉积于细胞内或细胞周围，而形成甲瓒的量与细胞增殖程度成正比［7］。我们发现，用MTT 法检测细胞增值与计数法结果非常一致，可以认为MTT法也可作为检测细胞生长状态的间接方法。

    3.4  关于人Tenon′s 囊成纤维细胞离体培养的几点体会  ①细胞原代培养采用组织块培养方法较细胞消化法简便，不需要胰酶消化，也避免了因消化时间过长导致的细胞生长不良。但组织块要尽量剪碎，如果组织块过大，细胞不易游出且组织块容易脱落；②我们对促进组织块贴壁的方法做了一点改进，即采用湿房的方法。当把剪碎的组织块均匀放入培养瓶底后，可将培养瓶倒置，加入少量培养基，使组织块处于湿房中，待组织块贴壁完全后，再将培养瓶翻转至正位进行组织块培养。这样即有利于使组织块尽快贴壁，又避免了组织块干燥，使细胞培养更容易存活；③人Tenon′s囊成纤维细胞离体培养时，取材的组织要尽量新鲜，采用1640或DMEM培养基均可，向培养基中加入10%的胎牛血清即可使细胞较易于生长。在此基础上适当上调或下调胎牛血清的量，可使细胞生长速度相应加快或降低。原代培养换液不要太频繁，更不利于细胞生长。传代培养因细胞生长较快，可3?d更换一次培养液。每次加入培养液要适量，过多容易造成污染。参考文献:

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［3］ 鄂征.组织培养技术［M］.北京:人民卫生出版社，1985:135.

［4］ 翼建平,叶天才. 青光眼非穿透性滤过性手术的进展［J］.国外医学眼科学分册, 2001, 25(3):110115.

［5］ 司徒镇强，吴军正.细胞培养［M］.西安:世界图书出版社，1996:176177.

［6］ R.I. 弗雷什尼. 实用动物细胞培养技术［M］.潘李珍,译.北京:世界图书出版社，1996.

［7］ 郑永唐，贲昆龙.测定细胞存活和增殖的方法的建立［J］.免疫学杂志，1992，8（4）：266269.