葡萄糖调节蛋白在糖尿病性白内障发病机制中的作用

作者：李漫丽    作者单位：吉林大学附属第二医院 眼科，吉林 长春 130041

  【摘要】  目的 探讨葡萄糖调节蛋白（78 kd glucose－regulated protein，grp78）在糖尿病性白内障发病机制中的作用。方法 32只Wistar大鼠随机分为4组：链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）糖尿病大鼠1、2、3个月模型组及正常对照组，每组8只。对大鼠采用STZ 60 mg/kg的剂量一次性腹腔注射制备糖尿病模型。各时段分批处死大鼠，每只大鼠左眼采用免疫组织化学法，右眼用半定量RT-PCR的方法检测晶状体上皮细胞中grp78的表达情况。结果 Grp78在正常大鼠晶状体上皮细胞中少量表达，免疫组化光密度值为28.66±5.90，RT-PCR检测光密度比值为0.889±0.006；糖尿病大鼠1、2、3个月组免疫组化光密度值分别为49.56±6.54、63.74±9.05、78.15±9.05，RT-PCR光密度比值分别为0.920±0.011、0.948±0.004、0.976±0.006。经统计学分析，糖尿病组大鼠晶状体上皮细胞中grp78的表达较正常组高（P<0.01），并随着病程的延长而表达增加（P<0.05）。结论 葡萄糖调节蛋白参与了糖尿病性白内障的发生、发展。

【关键词】  糖尿病性白内障 葡萄糖调节蛋白 晶状体上皮细胞 大鼠

   葡萄糖调节蛋白(78 kd glucose－regulated protein，grp78)是一种新发现的分子伴侣，属于热休克蛋白家族，是存在于内质网上最多的伴侣蛋白，其生理功能是参与细胞内新生蛋白的合成和转运。近来关于grp78与疾病发生、发展的关系研究比较活跃。糖尿病性白内障是糖尿病的常见眼科并发症，发病机制复杂，本研究应用链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导大鼠糖尿病性白内障模型，观察grp78在晶状体上皮细胞（lens epithelial cells，LECs）中的表达变化，探讨grp78在糖尿病性白内障发病机制中的作用及意义。

    1  材料和方法

    1.1  实验动物  健康雄性Wistar大鼠32只，清洁级，体重220～250 g，由吉林大学动物中心提供。适应性饲养1周，随机分为4组：糖尿病（diabetes mellitus，DM）模型1个月组（DM1）、2个月组(DM2)、3个月组（DM3）和正常对照组，每组各8只大鼠（16眼）。各时段分批处死大鼠，左眼用免疫组织化学法检测晶状体上皮细胞中grp78的表达情况，右眼用半定量RT-PCR方法检测grp78 mRNA的表达。

    1.2  主要试剂  链脲佐菌素（美国Sigma公司），兔抗鼠grp78抗体（美国Stressgen公司），免疫组化Biotin SP－HRP Kit（北京中杉公司），Trizol（invitrogen公司），M-MLV逆转录酶、Taq酶（Takara公司），引物设计合成、PCR Marker DL－2000（大连宝生物公司）。

    1.3  动物模型的建立[1]  模型组：以0.1 mol/L STZ，pH值为4.2的柠檬酸缓冲液溶配制成1%的STZ溶液(用前新鲜配制)。大鼠禁食12 h后称体重，每只大鼠按60 mg/kg体重一次性腹腔注射STZ，3 d后在鼠尾取血，用血糖仪测血糖，空腹血糖≥16.7 mmol/L为模型建立成功，成模后每个月测定一次血糖。正常对照组采用一次性腹腔注射0.1 mol/L的柠檬酸缓冲液，于3个月后处死。分别在糖尿病成模后1、2、3个月，分批过量麻醉处死大鼠，迅速摘取眼球，左眼行免疫组织化学法，右眼行半定量RT-PCR法检测grp78的表达。

    1.4  免疫组织化学染色　 迅速摘取眼球，放入10％中性甲醛中固定至眼球全部下沉，取出后进行常规洗涤、脱水、透明、浸腊包埋，从经过视乳头附近的子午线向两侧行矢状面连续切片。石蜡切片经常规脱腊、复水；按照免疫组化试剂盒说明行常规过氧化物酶标记的链霉卵蛋白（Streptavidin/Peroxidase，SP）法染色，在400显微镜下观察LECs中grp78的表达情况。染色阳性反应物质为棕黄色颗粒，每组标本取5张切片，每张切片取5个视野，数码照相机采集图像，用Image-pro-plus 6.0图像分析软件测定细胞平均光密度值（A值），并取平均值进行统计学分析。

  1.5  逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)  大鼠处死后立即摘除眼球，沿角巩膜缘撕除角膜，完整取出晶状体，取下晶状体囊膜，用Trizol提取总RNA，10 μl DEPC水溶解RNA沉淀，紫外分光光度计测定RNA量，按照试剂盒说明进行RT－PCR反应。Grp78引物序列为：上游：5′－AGCCCACCGTAACAATCAAG-3′，下游：5′-TCCAGCCATTCGATCTTTTC-3′，预计扩增片段长度为445 bp，β-actin用作内参照（片段长度560 bp）。PCR反应条件：95℃预变性5 min。循环：95℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸60 s，30个循环后，72℃再延伸10 min。取6 μl PCR产物，分子量标准为DL－2000，以1.2%琼脂糖凝胶电泳分离目的基因片断，溴化乙淀(0.5 μg/ml)染色，在紫外灯下观察并摄片，用bandscan图像分析系统测定条带光密度值，grp78 mRNA定量应用半定量法，即目的基因产物光密度值和内参照光密度值比，取各组平均值进行统计学分析。

    1.6  统计学方法  所有数据以均数±标准差表示，采用SPSS10.0软件包进行处理，各组之间采用单因素方差分析。

    2  结果

    2.1  晶状体变化情况  实验过程中正常组大鼠晶状体全部透明；糖尿病组在成模后第6周可见部分大鼠晶状体出现不均匀混浊，第2个月末混浊进一步加重，第3个月末所有大鼠晶状体均呈现白色混浊，眼底窥不入。

    2.2  Grp78蛋白的表达情况  免疫组织化学结果显示（见图1）：正常对照组大鼠LECs中见grp78少量表达，在LECs细胞质内可见棕黄色颗粒；糖尿病性白内障组LECs中grp78表达增多，各组与对照组相比，差异均有统计学意义（P<0.01），并且grp78的表达随着糖尿病病程的发展而增加。DM2组较DM1表达增多（P<0.05），DM3组较DM2组表达增多（P<0.05）（见表1）。

    2.3  RT-PCR检测grp78 mRNA的表达  电泳结果见图2，光密度比值（A值）统计学分析见表1。结果可见，糖尿病组grp78 mRNA的表达较正常对照组升高（P<0.01），DM2组较DM1组表达增多（P<0.01），DM3组较DM2组表达增多（P<0.01）。

    3  讨论

     葡萄糖调节蛋白[2-4]是存在于内质网上最多的伴侣蛋白，与热休克蛋白有同源性，又名免疫球蛋白结合蛋白（binding protein，BIP）。在生理情况下主要参与新生蛋白质的合成和转运，在缺血低氧、氧化应激、钙离子失衡等各种应激刺激时，大量蛋白质在内质网内变性、积聚，此时grp78的表达显著增加。其一方面协助变性蛋白进行重新装配及跨膜转运，缓解内质网压力；另一方面将无法恢复的蛋白质转移给蛋白降解系统降解，从而避免细胞进一步受到伤害。此机制提高了细胞在应激情况下的生存能力和促进应激后细胞康复，因此，grp78被认为是细胞内质网应激反应的标志性分子，并且具有保护细胞，对抗细胞调亡的作用。当这些机制不足以恢复内质网平衡时，细胞将启动凋亡程序，清除不健康的细胞，所以，grp78的表达多少反映了细胞的损伤情况和应激能力，对应激细胞的结局，如抵抗、适应、损伤或凋亡等有重要的决定作用。

    糖尿病性白内障的发病机制复杂，是多因素、多途径作用的结果[5-6]。晶状体无血管供给及神经支配，易遭受各种应激因子的损害，使晶状体内变性蛋白增多，透明晶状体出现混浊，发生白内障。而LECs是维持晶状体正常代谢的重要场所，是晶状体内代谢最活跃的部位，LECs凋亡是白内障发生的重要原因，它发生于晶状体混浊之前[7]，所以，研究LECs对各种有害因子的应激能力具有重要的意义[8-9]。本实验构建STZ糖尿病大鼠模型，通过检测LECs中grp78的动态表达，了解糖尿病早期LECs的应激及防御能力。我们的研究结果显示，grp78在正常大鼠LECs中少量表达，在早期糖尿病模型大鼠LECs中表达增高，并且随着糖尿病病程的延长，其表达量逐渐增高，此结果说明在糖尿病的发生、发展过程中，LECs在高氧化、高渗等各种应激状态下，细胞内大量未折叠蛋白和变性蛋白堆积，刺激grp78的高表达。我们认为，在糖尿病早期，LECs在不良环境刺激下grp78的表达增加，有助于协助清除变性蛋白， 增强细胞保护[10]；而当损害因子持续作用于晶状体，超出了保护机制的力量时，将出现LECs凋亡。Haynes等[11]的研究证实分子伴侣对细胞内未折叠和错误折叠蛋白的清除，能够抵抗氧化应激反应，延缓细胞的凋亡，所以若能在糖尿病损伤早期对grp78表达水平加以干预，可为临床治疗和干预提供理论依据，此方面尚需要进一步研究。

【参考文献】[1] 朱宝义，郭勇，王永强. 糖尿病性白内障动物模型的建立与评价[J]. 南方医科大学学报，2006，26（5）：707-708.

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[3] 张莹，孙黎光. Grp78的研究进展[J]. 国外医学（生理病理科学与临床分册），2005，25（3）：251-253.

[4] Lee AS. Mammalian stress response：induction of the glucose regulated protein family[J]. Curr Opin Cell Biol，1992，4（2）：267-273.

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[8] Ikesugi K， Yamamoto R， Mulhern ML. Role of the unfolded protein response (UPR) in cataract formation[J]. Exp Eye Res， 2006，83(3)：508-516.

[9] Mulhern ML， Madson CJ， Danford A， et al. The unfolded protein response in lens epithelial cells from galactosemic rat lenses[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2006，47(9)：3951-3959.

[10] 徐国兴，胡建章，王婷婷，等. HSP70在STZ-糖尿病性白内障发病机制中的作用[J]. 眼视光学杂志，2003，5（1）：1-3.

[11] Haynes CM， Titus EA， Cooper AA. Degradation of misfolded proteins prevents ER-derived oxidative stress and cell death[J]. Mol Cell，2004，15（5）：767－776.