光催化剂TiO2对牛晶状体上皮细胞作用的实验研究

作者：陈迎月

【摘要】  目的 研究经长波紫外线(UVA)激发后光催化剂二氧化钛(TiO2)对细胞的杀伤作用和机制，探讨光催化剂 TiO2应用于防治后发性白内障的可能性。方法 将牛晶状体上皮细胞（lens epithelial cells，LEC）与不同浓度的TiO2共同孵育。按TiO2浓度分为对照组(0 μg/ml)和实验组(100 μg/ml、150 μg/ml和200 μg/ml)，分别予UVA激发0、20、30和40 min。采用MTT比色法测定经UVA激发的TiO2对牛LEC的杀伤效应。按TiO2浓度分为对照组(0 μg/ml)和实验组(200 μg/ml)。对照组UVA激发0、40 min，实验组UVA激发0、30和40 min。采用DNA琼脂糖凝胶电泳探讨光催化杀伤机制。按TiO2浓度分为对照组(0 μg/ml)和实验组(200 μg/ml)。分别予UVA激发0和30 min。采用电镜技术观察光催化后细胞形态学变化。结果 MTT比色法测定结果：在UVA激发下，TiO2对牛LEC杀伤率随着TiO2浓度增加和激发时间延长而增加，TiO2作用浓度达到150 ?滋g/ml且激发时间超过30 min或浓度达到200 ?滋g/ml，其杀伤作用与相同UVA激发时间对照组相比，差异有统计学意义。200 ?滋g/ml TiO2组照射30 min以上，提取DNA进行琼脂糖凝胶电泳显示，样品电泳迁移速率大于对照组，并在电镜下观察到大量细胞有坏死超微结构改变。结论 在UVA的激发下，光催化剂TiO2可以明显杀伤牛LEC，杀伤效应具有时效和量效关系。TiO2的应用可能成为防治后发性白内障的新途径。

【关键词】  光催化剂 二氧化钛 晶状体上皮细胞 后发性 白内障

    术后残留的晶状体上皮细胞（lens epithelial cells，LEC）过度增殖并迁徙至晶状体后囊膜所引发的一系列组织变化是后发性白内障（posterior capsule opacification，PCO）发生的病理基础[1]，因此，如何抑制LEC增殖是临床防治PCO的首要问题。

    近年来，国内外学者利用光催化剂二氧化钛(TiO2)经光激发产生超氧化物这一特点在杀灭肿瘤细胞方面进行了研究，证实该催化剂在体外可以有效杀灭肿瘤细胞[2-4]。本研究探讨了经长波紫外线(ultraviolet-A，UVA，320~400 nm)激发后光催化剂TiO2在体外条件下对牛晶状体上皮细胞的杀伤作用和机制，探讨将其应用于防治PCO的可能性。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    1.1.1  试剂  MTT（AMRESCO公司，USA）；DMSO（AMRESCO公司，USA）；DMEM（GIBCO公司，  USA）；小牛血清（PAA公司，Austria）；胰酶（HYCLONE公司，USA）；PBS（福州迈新生物技术开发有限公司）；TiO2（福州大学光催化研究所提供的自制商品肽胶，60℃恒温48 h，研磨，400目过筛）。

    1.1.2  仪器   超净工作台（苏州净化设备有限公司）；CO2细胞培养箱（300/3000 Series，REVCO， USA）；倒置相差显微镜（OLYMPUS CK40，Japan）；酶标仪（STAT FAX 2100，USA）；365 nm紫外灯（上海飞利浦U形灯管，8W）；光强测定仪（SUV，UV-METER，中国计量科学研究所）； 电位粒度仪（MALVERN，ZETASIZER 3000HSA，USA）；电泳槽（ 北京三恒多用电泳仪）； 凝胶成像分析系统 （Bio-Rad公司凝胶成像系统及quantity-one分析软件，美国）；透射电镜（日立Hu-12A型）。　

    1.2  实验方法

    1.2.1  牛LEC原代培养及传代培养  参照胡建石等[5]组织块静置培养法对牛LEC进行原代培养及传代培养。实验选取2~3代LEC与不同浓度的TiO2共同孵育。

    1.2.2  制备TiO2混悬液  称取所需TiO2，高压灭菌，加入含10%小牛血清及DMEM培养液配成所需浓度，在电磁力搅拌机上搅拌30 min。电位粒度仪测定平均粒径为508.5 nm。用pH测量计测量加入TiO2的培养液pH值为7.1±0.2。

1.2.3  MTT比色法测光催化杀伤效应  按TiO2浓度分为对照组(0 μg/ml)和实验组(100 μg/ml、150 μg/ml和200 μg/ml)，分别予UVA激发0、20、30和40 min。共有16组。具体操作：将100 μl牛LEC单细胞悬液（105个/ml）接种于96孔培养板，置37℃、5% CO2的培养箱中培养24 h后，对照组加100 μl DMEM完全培养液，实验组加100 μl含不同TiO2浓度的培养液，使其终浓度分别为100 μg/ml、150 μg/ml和200 μg/ml。每一浓度设3个重复孔。继续孵育24 h后，用365 nm紫外灯激发0、20、30和40 min。照射强度用光强测定仪测定为（0.185±0.055） mW/cm2。照射后表面温度升高，但不超过37℃。UVA激发后继续培养24 h，用MTT比色法检测。以UVA激发时间为0 min的对照组培养孔为阳性对照，以只含培养液的培养孔为阴性对照，计算各组细胞杀伤率。计算方法：细胞存活率=（实验组A值-本底A值）÷（对照组A值-本底A值）×100%； 细胞杀伤率=1-细胞存活率。

    1.2.4  DNA琼脂糖凝胶电泳探讨细胞杀伤机制

    按TiO2浓度分为对照组(0 μg/ml)和实验组(200 μg/ml)。对照组予UVA激发0、40 min，实验组予UVA激发0、30和40 min。共5组。具体操作为：将2 ml牛LEC单细胞悬液（105个/ml）接种于6孔培养板，置37℃、5% CO2的培养箱中培养24 h后，对照组换液加2 ml DMEM完全培养液，实验组加2 ml 200 μg/ml TiO2混悬液。继续孵育24 h后用365 nm紫外灯激发（对照组激发0、40 min，实验组激发0、30和40 min）。孵育24 h后将处理过的细胞消化下来，1500 r/min离心5 min，弃上清，重悬于1 ml PBS。4℃ 2000 r/min离心5 min，弃上清，加入  20 μl溶解缓冲液（20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris pH值为8.0，0.8% SDS）及10 μl RNA酶A（500 U/ml）混匀，37℃孵育30 min。加10 μl蛋白酶K（20 mg/ml）混匀，50℃孵育90 min。在含0.5 μg/ml溴化乙锭TBE的2%琼脂糖凝胶干孔中加20 μl DNA样品和4 μl 6х DNA加样缓冲液（30%甘油，0.25%溴酚蓝）。35 V电压下电泳4 h，于紫外透射仪上观察电泳结果并拍照保存。

    1.2.5  电镜观察细胞形态学改变  按TiO2浓度分为对照组(0 μg/ml)和实验组(200 μg/ml)。分别予UVA激发0和30 min。共4组。具体操作：消化牛LEC接种于6孔培养板；培养至80%融合后实验组换液加入2 ml 200 μg/ml TiO2混悬液，对照组加入2 ml DMEM完全培养液；孵育24 h后用365 nm紫外灯激发0和30 min；孵育3 h后将处理过的细胞消化下来，1500 r/min离心5 min，弃上清；然后加2.5%戊二醛固定，环氧树脂包埋，切片，染色后电镜观察。

    1.3  统计学方法  本研究使用SPSS10.0软件包对MTT比色法所测的A值进行统计学析因分析，比较不同浓度TiO2组与相同激发时间对照组的结果。

    2  结果

    2.1  MTT比色法测TiO2在UVA激发下对牛LEC的杀伤效应呈时效和量效关系  对MTT比色法所测的A值进行统计学析因分析。以TiO2浓度为主效应时，F=5.154，P=0.003；以激发时间为主效应时，F=8.086，P=0.000，提示不同TiO2浓度在不同激发时间所测的A值不同。TiO2作用浓度达到150 ?滋g/ml且激发时间超过30 min或浓度达到200 ?滋g/ml与相同激发时间对照组相比，差异有统计学意义(见表1)。

    2.2  DNA琼脂糖凝胶电泳显示，200 ?滋g/ml TiO2组UVA激发后样品电泳迁移速率大于对照组，未出现凋亡细胞DNA所特有的梯状条带，却出现坏死细胞DNA所显示的模糊的弥散条带。结果表明，TiO2经UVA激发后使牛LEC中DNA链断裂，分子量降低(见图1)。

    2.3  电镜下观察对照组大部分为正常LEC（见图2）。200 ?滋g/ml TiO2组UVA激发前可见许多吞噬TiO2颗粒的溶酶体（见图3）。UVA激发30 min后见大量细胞有坏死超微结构改变，如胞质内见内质网扩张，线粒体嵴断裂，基质密度增加，可见到絮状物沉淀。另外可见细胞膜破裂、不完整等（见图4）。

  3  讨论

     目前，PCO的临床治疗主要是Nd：YAG激光后囊膜切开术及手术治疗，但由于其可引起一些严重的并发症，如黄斑囊样水肿、视网膜脱离、眼压升高等，限制了临床应用。改良白内障手术方式和人工晶状体的设计虽可降低PCO的发生率，但还无法根本解决LEC增殖问题。抗代谢药物、特异性单克隆抗体及基因治疗技术的应用虽可在体外抑制LEC增殖，但因毒副作用大而难以应用于临床[6-7]，因此， 探索和研究新的治疗方法是防治PCO普遍关注的问题。

    光催化是近20年来最活跃的化学研究领域之一，在众多的光催化剂中，半导体二氧化钛（TiO2）因其化学性质稳定、耐酸、耐碱，具有良好的生物相容性，对人体无害等而成为最理想的光催化剂。TiO2作为一种半导体材料具有很好的光催化活性，当其吸收的能量大于其禁带宽度的光子后，价带电子被激发至导带，产生电子-空穴对；而光生空穴具有很强的氧化性，因而能催化附着于TiO2周围的水分子分解产生羟基自由基，这些活性氧类自由基易与生物大分子如脂类、蛋白质、酶类以及核酸大分子反应，直接损害或通过一系列氧化链式反应而对生物细胞结构引起广泛的损伤性破坏[8-9]。Kubota等[3]利用TiO2颗粒结合300~400 nm紫外灯照射体外培养的T-24人膀胱癌细胞，可观察到明显的细胞杀伤效应，同时也明显抑制移植在裸鼠体内的T-24肿瘤的生长，并证明光生电子-空穴对与细胞杀伤有关。本研究发现，在UVA的激发下，TiO2可以明显杀伤牛LEC，杀伤效应呈一定的时效和量效关系。虽然UVA对正常LEC有杀伤作用，但加入TiO2后可大大提高杀伤效率。对照组UVA照射30 min杀伤率为29.15%，照射40 min杀伤率为38.75%。而200 ?滋g/ml TiO2组UVA激发30 min杀伤率为54.06%，激发40 min杀伤率就可达到72.14%。我们发现，虽然加入TiO2可以大大增加杀伤效应，但是TiO2作用浓度需达到150 ?滋g/ml，且激发时间超过30 min或浓度达到200 ?滋g/ml，与对照组相比差异才有统计学意义。这是因为TiO2需要有一定的作用浓度及激发时间。有研究表明，其作用效率与其浓度、照射光密度及反应温度有关，而pH值则不影响[10]。我们从DNA琼脂糖凝胶电泳和电镜结果可以推测，光催化剂TiO2微粒附着于晶状体上皮细胞膜上并加以聚集时，细胞通过其内吞作用而将微粒内化进入细胞体内，经UVA激发后在晶状体上皮细胞表面和细胞浆中产生活性氧物质氧化细胞膜，使其破坏而泄露，结果外部物质进入细胞内，使细胞功能单位失活并使DNA链断裂而致细胞死亡。

    我们的研究表明，在UVA的激发下，光催化剂TiO2可以明显杀伤牛LEC，那么也可应用于杀伤白内障术后残留的LEC，有望成为防治PCO的新途径。TiO2微粒具有良好的生物相容性，对人体无害，使其在眼内应用成为可能。有学者在老鼠腹腔内注入含25 mg TiO2的盐溶液，没有观察到异体反应及肿瘤细胞产生[11]。TiO2光催化剂只对靶细胞产生杀伤作用，而不会损伤到周围其他正常细胞。TiO2电极与细胞接触时，一个TiO2微电极在紫外线的照射下仅灭活单个T-24细胞，当电极与细胞表面仅相距10 nm时，细胞就不会被杀死[12]。但其在眼内应用的安全性还需要进一步研究。当然，悬浮相光催化剂有易失活、易凝聚、难分离、利用率低等弊端，而采用催化剂固定技术是解决这一问题的有效途径。我们设想进一步在人工晶状体表面制备TiO2基纳米光催化剂薄膜，并设想通过改变催化剂的组成和结构，调变催化剂对可见光的吸收，从而实现在可见光激发下光催化剂对细胞的生长有破坏作用，但又不对其他组织产生副作用，从而增加其应用的可能性。

【参考文献】  [1] Apple DJ， Solomon KD， Tetz MR， et al. Posterior capsule opacification[J]. Surv Ophthalmol，1992，37(2)：73-116.

[2] Zhang AP， Sun YP. Photocatalytic killing effect of TiO2 nanoparticles on Ls-174-thuman colon carcinoma cells[J]. World J Gastroenterol，2004，10(21)：3191-3193.

[3] Kubota Y， Shuin T， Kawasaki C， et al. Photokilling of T-24 human bladder cancer cells with titanium dioxide[J]. Br J Cancer，1994，70(6)：1107-1111.

[4] Sakai H， Ito E， Cai RX， et al. Intracellular Ca2+ concentration change of T-24 cell under irradiation in the presence of TiO2 ultrafine particles[J]. Biochim Biophys Acta，1994，1201(2)：259-265.

[5] 胡建石，翁景宁，郑志竑. 成年牛晶状体上皮细胞培养、冻存与复苏[J]. 上海实验动物科学，2002，22(4)：223-226.

[6] 翁景宁，张惠蓉. PCNA反义寡脱氧核苷酸对牛晶状体上皮细胞体外增殖活性的影响[J]. 眼科研究，2001，19(3)：199-201.

[7] 王冰，翁景宁. 腺病毒载体介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鸟苷体系对晶状体上皮细胞的作用[J]. 中华眼科杂志，2002，38(10)：618-622.

[8] Shephard GS， Stockenstrom S， de Villiers D， et al. Degradation of microcystin toxins in a falling film photocatalytic reactor with immobilized titanium dioxide catalyst[J]. Water Res， 2002，36(1)：140-146.

[9] Ashikaga T， Wada M， Kobayashi H， et al. Effect of the photocatalytic activity of TiO2 on plasmid DNA[J]. Mutat Res-Gen Tox En，2000，466(1)：1-7.

[10] Cho M， Chunq H， Choi W， et al. Linear correlation between inactivation of E. coli and OH radical concentration in TiO2 photocatalytic disinfection[J]. Water Res，2004，38(4)：1069-1077.

[11] Stringer B， Imrich A， Kobzik L. Flow cytometric　assay of lung macrophage uptake of environmental particulates[J]. Cytometry， 1995，20(1)：23-32.

[12] Blake DM， Maness PC， Huang Z， et al. Application of the photocatalytic chemistry of titanium dioxide to disinfection and the killing of cancer cells[J]. Separ Purif Method，1999，28(1)：1-50.