嗅鞘细胞移植联合应用GDNF对大鼠视神经不全损伤后功能恢复的作用

　　作者：高波,袁铸　　作者单位：中国湖北省武汉市，武汉科技大学附属医院眼科

　　【摘要】 目的：探讨嗅鞘细胞(OEC)移植和人重组胶质细胞源性神经营养因子(recombinant human glial cell line- derived neurotrophic factor，rhGDNF)对大鼠视神经不全损伤后功能恢复的作用。方法：采用无创血管夹在成年大鼠制作视神经不全损伤模型，分为玻璃体腔注射rhGDNF、视神经损伤处注射OEC、rhGDNF+OEC联合治疗组和对照组。在损伤前、损伤后即刻及伤后1，2，4，8 和12 wk检测伤眼闪光视觉诱发电位。结果：视神经损伤后即刻闪光视觉诱发电位波形呈熄灭状。伤后1wk各治疗组和对照组潜伏期基本恢复至损伤前水平。振幅恢复缓慢，伤后1～2wk治疗组与对照组比较无显著差异(P >0.05);4wk以后rhGDNF组和OEC组与对照相比间差异显著(P <0.05)，GDNF+OEC组与对照组相比差异非常显著 (P <0.01) 。8wk时对照组恢复至损伤前的43.1%，GDNF治疗组恢复至损伤前的51.5%，OEC治疗组恢复至损伤前的57.4%，而GDNF+OEC联合治疗组恢复至损伤前的68.7%，12wk后达75%。结论：嗅鞘细胞(OEC)移植和rhGDNF对大鼠视神经不全损伤后视神经功能的恢复有明显的促进作用，二者联合治疗效果更显著。

　　【关键词】 视神经;不全损伤;人重组胶质细胞源性神经营养因子;嗅鞘细胞;闪光视觉诱发电位

　　Effect of olfactory ensheathing cells and rhGDNF on functional recovery of optic nerve following incomplete injury in rats

　　Bo Gao, Zhu Yuan

　　Department of Ophthalmology, the Affiliated Hospital of Wuhan University of Science & Technology, Wuhan 430064, Hubei Province, China

　　Abstract AIM: To investigate the effect of olfactory ensheathing cells (OEC) transplantation and recombinant human glial cell line- derived neurotrophic factor (rhGDNF) on the functional recovery following incomplete injury of the optic nerves in adult rats. METHODS: The optic nerves of adult rats were crushed by forceps and then rhGDNF was injected into vitreous cavity, OEC transplanted into injured optic nerve, or rhGDNF combined with OEC, and distilled water was used in control group. Flash-visual evoked potential (F-VEP) examinations were performed before, immediately and 1, 2, 4, 8 and 12 weeks after injury. RESULTS: F-VEP waveform was almost silent pattern after optic nerve was crushed. The latency of F-VEP (LP1) recovered nearly to the normal value on the first week in treated groups and the control. While the amplitude recovered more slowly, with no significant recovery after 1-2 weeks (P>0.05). At 4 weeks rhGDNF group and OEC group recovered significantly (P <0.05), especially the rhGDNF combined with OEC group (P<0.01). The recovery ratio of amplitude was 43.1% in treated group, 51.5% in rhGDNF group, 57.4% in OEC group and 68.7% in rhGDNF combined with OEC group on 8 weeks after injury, and reached 75% after 12 weeks in combination group. CONCLUSION: OECs transplantation and rhGDNF injection can promote the recovery of visual function after incomplete injury of optic nerve in adult rats, and combination OEC with rhGDNF will be more effective.

　　• KEYWORDS: optic nerve; incomplete injury; recombinant human glial cell line-derived neurotrophic factor; olfactory ensheathing cells; flash visual evoked potentials

　　0引言

　　视神经损伤后很难再生，目前认为应用细胞移植、给予外源性神经营养因子等多种方法改善损伤局部的微环境，可以促进损伤的视神经纤维再生。由于各种治疗方法对神经组织的作用方式不同，其中两者联用可能产生超过单一因素的作用，因此，多种治疗方法的联合使用是今后可能治疗方案的主要研究方向。嗅鞘细胞(OEC) 兼具星型胶质细胞、少突胶质细胞和神经细胞的特点，既往的研究表明，其对中枢神经的再生具有促进作用，因此近年来受到人们的高度重视，被广泛用于中枢神经系统损伤的细胞移植。研究表明，OEC被植入损伤的中枢，可以形成细胞桥引导神经轴突生长，并向远距离延伸[1]。胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)是在体外促进神经元生长最有效的神经营养因子之一，不仅能挽救发育过程中神经元的凋亡，还可以促进神经损伤后皮质神经元的存活。在离体实验和坐骨神经切断术后均观察到GDNF对脊髓运动神经元和周围神经具有明显的保护作用[2]。那么推测视神经损伤后GDNF对视神经的再生和功能恢复具有重要意义。采用闪光视觉诱发电位(F-VEP) 评价嗅鞘细胞移植和GDNF对视神经不全损伤后功能恢复的影响，以及这两者联用时对视神经损伤治疗的协同作用。

　　1材料和方法

　　1.1材料　 采用改良的Nash等[3]的方法。取3mo龄雄性SD大鼠(武汉科技大学实验动物中心提供) 的嗅神经层及嗅球颗粒层，以2.5g/L胰酶消化，终止消化后用含200mL/L 胎牛血清的DF12培养基吹打成单细胞悬液，接种于未涂胶的玻璃培养瓶，置5mL/LCO2孵育箱37℃培养12h后将培养上清连同未贴壁细胞转种于另一个未涂胶的玻璃培养瓶，再培养12h，调整细胞密度为1×109/L，种植于经多聚赖氨酸处理的6孔板，培养1wk，加入Ara-C (终浓度为10-5mol/L ) 作用48h，清洗后培养液中添加2μmol/L forskolin和20mg/L BPE (Sigma)，继续培养10d后进行移植，并用S-100 (Sigma) 进行常规免疫组化染色，以确定纯度。低浓度Hoechet 和适当的作用时间可以使细胞核产生荧光标记而不影响其细胞活性。移植用OEC大部分采用直接消化收集，终浓度为 1×1010/L;少部分用10mg/ L二苯甲亚胺(Hoechet 33342，Sigma) 于37℃孵育30min 进行核标记，后用无血清DF12清洗2次，消化收集为同样的浓度，准备移植。速眠新(0.5mL/kg) 肌肉注射麻醉，大鼠侧卧位，于显微镜下剪开外眦角及颞侧球结膜，分离结膜下组织及球后组织，暴露视神经，用无创血管夹于球后1.5mm钳夹视神经10s，造成中度视神经损伤(参照前期实验已建立的大鼠视神经不同程度不全损伤模型)。避免损伤眼动脉，术后滴抗菌素眼液，涂抗菌素眼膏。单眼(右眼) 手术，术后观察大鼠眼底血液供应情况，确认无缺血者纳入实验。成年雌性Wistar大鼠120只，体质量150～200g，由武汉科技大学实验动物中心提供。随机分为玻璃体腔注射rhGDNF、视神经损伤处注射OEC、rhGDNF+OEC联合治疗组和对照组(对照本应设玻璃体腔注射生理盐水、视神经损伤处注射生理盐水和玻璃体腔联合视神经损伤处同时注射生理盐水3组，但损伤后组织局部体液聚集，预实验也证实视神经损伤处注射生理盐水对病变进展没有任何影响，故对照组为玻璃体腔注射生理盐水)各30只。并分为伤后1，2，4，8 和12wk 5个时间点，2组每时间点各6只动物。实验期间，动物在同一条件下由武汉科技大学实验动物中心喂养。

　　1.2方法 动物麻醉后，用消毒后的10μL微量推进器吸取药物，于大鼠眼球上方赤道部(距角巩膜缘3mm) 斜向后下方进针，于瞳孔直视下观察针尖避免损伤晶状体，玻璃体腔内注射rhGDNF 2μL (2μg) ，对照组玻璃体腔内注射无菌双蒸水2μL。视神经不全损伤上下各1mm处用微量推进器移植OEC悬液共2μL(多点注射，每点0.5μL) 。注射时间为损伤即刻、术后1，2，4和8wk。rhGDNF的制备见文献[4]，纯度96%。动物损伤眼于损伤前、损伤后即刻及处死前检测F-VEP。采用AVES8000 视觉电生理系统，动物麻醉后用特制支架固定，采用银针电极，记录电极插入大鼠枕骨粗隆骨膜下，参考电极插入两眼正中皮下，地电极插入耳尖皮下。采用全视野刺激球白色闪光刺激，闪光强度为3. 93cds/m2，无背景光，刺激频率为2Hz，通频带宽为1～100Hz，放大倍数为2万倍，每次采样时间为250ms，波形叠加50次。每只动物记录3次，间隔10min。观察指标为F-VEP潜伏期LP1 (P1 波的反应时间，ms) 及振幅AP1-N2 ( P1 波谷至N2 波峰的峰值，μV)。所有数据取3 次的平均值。

　　统计学处理：采用SPSS11. 0软件中t 检验进行统计学分析，结果以均数±标准差(?)表示。P <0.05 为相差显著。

　　2结果

　　2.1 OEC纯度 纯化后培养6d，视野内大部分细胞可见突起，胞体立体感强，折光性好(图1A)，免疫组化证明为OEC (图1B)。纯化后培养10d左右细胞突起细长，呈双极或多级并连成网状。背底有较少量细胞，胞体较大，立体感差，形态不规则，呈薄纱状结构，为成纤维细胞。根据纯度检测计算(同一视野下组化着色的细胞数与全部细胞数之比) 纯度为90% 以上。

　　2.2 F-VEP 视神经损伤后即刻，F-VEP波形几近熄灭，潜伏期明显延长，振幅显著降低。伤后1wk，各治疗组和对照组潜伏期基本恢复至损伤前水平，与损伤前比较无显著性差异( P >0.05)，组间比较无显著性差异( P >0.05，图2) 。振幅恢复缓慢，伤后1～2wk治疗组与对照组比较无显著差异( P >0.05);4wk以后GDNF组和OEC组与对照相比间差异显著( P <0.05)，GDNF+OEC组与对照组相比差异非常显著(图3)。8wk时对照组恢复至损伤前的43.1%，GDNF治疗组恢复至损伤前的51.5%，OECs治疗组恢复至损伤前的57.4%，而GDNF+OEC联合治疗组恢复至损伤前的68.7%，12wk后达75%。

　　3讨论

　　视神经损伤后的修复是众多学者多年潜心研究的课题，它的突破也将给中枢神经损伤再生修复提供极为有意的线索。视神经RGC的轴突所组成，因此视功能的恢复与RGCs的损伤程度、轴浆转运物质合成功能状态、自身修复和再生能力均密切相关[5,6]。F-VEP 能客观地反映视神经损伤程度、神经传导的功能状态，可用作视网膜-视皮层传导功能的评估。F-VEP的潜伏期反映神经传导机能，表示神经轴突髓鞘的完整性，振幅反映黄斑视网膜感受机能，表示完整轴突及其与靶区突触联系的数量[7]。我们观察到伤后即刻F-VEP 波形几近熄灭，此时的视功能呈休克状态，可能是损伤区神经水肿致束内压增高、神经轴突缺氧，传导功能暂时阻断所致[8]。视神经伤后1 wk，对照组与治疗组潜伏期基本恢复至损伤前水平。潜伏期很快恢复说明神经休克缓解后只要存在一定量完整的视神经轴突髓鞘，且与靶组织存在正常的突触联系，视觉信息就可以在正常时间内引起皮层反应。Sabel等[9]研究证明，大约10 %的RGC与靶组织联系，光感可以恢复。而在临床上部分视神经损伤患者即使不治疗也可以恢复部分视力[10]。说明视神经不全损伤具有一定的自我修复能力。F-VEP 振幅在伤后4～12wk，随着轴突水肿消退、轴浆运输恢复以及轴突再生能力部分恢复，治疗组可恢复至损伤前的50%~60%，甚至70%，显著高于对照组，提示GDNF+OEC治疗促进了视功能的恢复。振幅不能完全恢复，且恢复慢，可能与视神经损伤后再生能力有限和神经组织进行性变性有关。因此我们认为动物实验中F-VEP 振幅比潜伏期更能反映其视功能。

　　rhGDNF具有多种生物学效应，被认为对神经元的存活和轴突再生具双重作用[1]。玻璃体腔内持续注射rhGDNF可能通过以下途径其作用：(1)替代靶源性的神经营养因子或促进其逆向运输;增强RGC 对原发损伤尤其是继发损伤的抵抗能力，减轻轻微损伤和未损伤的神经元继发变性、凋亡，从而起到RGC 较长期的保护作用，而延缓了神经组织变性的进程，保存相对较多的神经纤维;(2)增强其再生反应[11]，促进不全损伤后再生轴突的延长;(3)促进轴浆运输恢复，加强神经细胞内物质合成和新陈代谢，调节神经营养，缓解组织水肿，减轻局部压力，改善神经组织内环境，而有利于病变的神经纤维功能的恢复。然而我们发现，GDNF 在单独应用于脊髓损伤时，虽有一定的神经元逆行性保护作用，但其促进轴突再生的能力却与对照组无显著差别。这可能是由于：(1)虽然GDNF可以促进轴突再生，但再生的轴突却无法长过脊髓的损伤和瘢痕;(2)注入的GDNF无法在体内维持很久即被代谢。OEC 是一种处于中枢和外周神经系统过渡区的鞘细胞，其功能十分活跃，成为近年来治疗脊髓损伤的首选细胞之一。本研究亦证明，仅在有OEC 治疗的两组中，损伤的中枢轴突可以再生。我们首次发现虽然GDNF组与对照组轴突再生无显著差异，但当GDNF与OEC联合应用时，却可以促进OEC 对脊髓损伤的修复作用，即二者产生了协同作用。这种协同作用产生的可能机制有：(1)由于损伤晚期，胶质瘢痕分泌大量抑制性因子，并对轴突生长起到物理性阻碍作用，使GDNF无法促进再生的轴突穿过损伤处的胶质瘢痕。而OEC 可以克服这种不利的损伤微环境，起到一种细胞桥的作用，引导神经纤维生长，通过胶质瘢痕，使GDN F 促进轴突再生的作用得以显现;(2)GDNF可能对移植的OEC具有细胞保护作用，甚至促进其增殖，从而加强了OEC 的作用。因此本研究为视神经，乃至中枢神经损伤之后的再生修复做了积极探索，并提出具有一定临床应用价值的新的治疗方案。

　　【参考文献】

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　　3 Nash HH, Borke RC, Anders JJ. New method of purification for establishing primary cultures of ensheathing cells from the adult olfactory bulb. Glia ,2001;34(2):81-87

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　　11 Jo SA, Wang E, Benowitz LI. Ciliary neurotrophic factor is an axogenesis factor for retinal ganglion cells. Neuroscience ,1999;89(2):579-591