内源性大麻素对体外培养的牛眼小梁细胞PGE2表达及细胞骨架的影响

　　作者：陈丽,张德秀,刘明,杨晓岗,孙松林,张俊　　作者单位：中国陕西省西安市，西安交通大学医学院第一附属医院眼科;2(710002)中国陕西省西安市第一医院眼科

　　【摘要】 目的：研究内源性大麻素N花生四氢酸氨基乙醇(anandamide,AEA)对体外培养的牛眼小梁细胞细胞骨架及PGE2表达的影响。方法：对牛眼小梁细胞进行原代及传代培养，并行鉴定。对传3代的牛眼小梁细胞分别施加AEA浓度分别为0，0.1，1.0，10μmol/L的无血清培养液，作用24h后提取细胞上清液，并将细胞置于倒置显微镜下摄像，计算机图像分析系统计算细胞面积。用ELISA法检测PGE2浓度的变化。结果：AEA可以产生明显的细胞舒张效应，呈浓度依赖性。而且在一定范围内可以成剂量依赖性的促进PGE2的表达。与对照组均有显著性差异(P<0.05)。结论：AEA可引起小梁细胞的舒张和促进PGE2的释放。

　　【关键词】 牛眼小梁细胞;N花生四氢酸氨基乙醇;细胞骨架;前列腺素;青光眼

　　Effect of AEA on the expression of PGE2 and cytoskeleton in cultured bovine trabecular cells

　　Li Chen, DeXiu Zhang, Ming Liu, XiaoGang Yang, SongLin Sun, JunXia Zhang

　　1Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital, School of Medicine, Xian Jiaotong University, Xian 710061, Shaanxi Province, China; 2Department of Ophthalmology, the First Hospital of Xian City, Xian 710002, Shaanxi Province, China

　　Correspondence to：DeXiu Zhang.

　　Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital, School of Medicine, Xian Jiaotong University, Xian 710061, Shaanxi Province, China. qiaoxiao_chen@126.com

　　AbstractAIM: To study the effect of anandamide (AEA) on the expression of PGE2 and cytoskeleton in cultured bovine trabecular meshwork cells (BTM cells).METHODS: BTM cells were primarily cultured and subcultured. The third generation BTM cells were incubated with different dosages of AEA(0,0.1,1.0,10μmol/L，final concentration, diluted by DMEM)for 24 hours. Then the supernatant was collected. The morphology of BTM cells was observed by inverted microscope and the area of cells was calculated by computer image analytic system. The concentration of PGE2 in the medium was measured by the ELISA method.RESULTS: Compared with the control group, AEA could obviously induce the relaxation of BTM cells in a concentrationdependent manner. Moreover, in a certain range AEA can increase the expression of PGE2 in a dosedependent manner.CONCLUSION: AEA may cause the relaxation of TM cells and promote the release of PGE2.

　　KEYWORDS: bovine trabecular cell; anandamide; prostaglandins; cytoskeleton; glaucoma

　　引言

　　青光眼是世界范围内重要的致盲眼病。降低眼压是青光眼治疗的重要手段和过程，因为眼压是惟一已知的，也是惟一可被有效控制的导致视神经损害和视野缺损的危险因素。青光眼治疗的最终目的就是通过治疗使患者获得一个较为安全的眼压水平，在这个眼压水平下视功能不易发生近一步的视神经损害。同时通过对其他引起青光眼视神经和视野损害的非眼压因素和视神经的防护治疗使患者获得稳定的视功能。青光眼治疗的策略应该包括降低眼压，控制眼压波动，保护视神经。在很多情况下，眼压尽管得到了降低但仍然不能阻止青光眼的进展，其原因可能是由于眼压没有降低到靶眼压水平，或眼压不稳定、眼压波动太大，也可能是眼压在靶眼压水平，但视网膜神经节细胞的凋亡仍在进行[1]。N花生四氢酸氨基乙醇(anandamide， AEA)和前列腺素都具有降低眼压的作用，而且最近发现他们也都具有视神经保护作用[2,3]。有研究表明，AEA可以促进内源性前列腺素的生成[4]。但到目前为止，其具体作用机制仍不是很清楚。为探讨AEA的降眼压机制，我们用内源性大麻素AEA作用于牛眼小梁细胞，研究小梁细胞细胞骨架以及PGE2的变化如下。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　取屠宰场新杀小牛眼10只，死后4h内取材，4℃冰桶运回实验室。高糖型培养基购自Gibco公司,胎牛血清购自杭州四季青生物工程公司，神经元特异性烯醇化酶(NSE)、波形蛋白(vimentin)及VⅢ因子相关抗原(VⅢR:Ag)由第四军医大学病理教研室提供。胰蛋白酶、EDTA和内源性大麻素N花生四氢酸氨基乙醇(anandamide， AEA)购于Sigma公司。PGE2ELISA试剂盒购于上海森雄科技实业有限公司。

　　1.2方法

　　运用组织快培养法[57]将细胞游离出组织快后，每周换液2次。等细胞长满瓶底后，用1.25g/L胰蛋白酶和0.2g/L EDTA消化传代。取传2代的小梁细胞接种于预置盖玻片的培养皿内，待细胞贴壁2d后用0.01mol/L PBS清洗3次，40g/L的多聚甲醛固定，行NSE, vimentin及ⅧR：Ag免疫组化染色。另取细胞铺片。用4℃预冷的20g/L戊二醛固定，送电镜室制作常规透射电镜标本。取传3代的牛眼小梁细胞以 1×107/L 的密度接种于96孔板中，待细胞融合后，无血清培养 24h后，让细胞同步化，随机分为 4组，每组浓度设10个复孔，分别施加AEA终浓度为 0(对照组)，0.1，1，10μmol/L的培养液(不含血清)。培养24h后吸出对应孔中的细胞上清，分装于EP管，20℃保存待测。并将细胞放置倒置显微镜下观察并照像，运用计算机图像分析系统计算细胞面积。最后按照ELISA试剂盒中的说明进行操作，检测PGE2的浓度;建立标准曲线：设标准孔8孔，每孔各加入样品稀释液100μL，第1孔加标准品100μL，混匀后用加样器吸出100μL，移至第2孔。如此反复对倍稀释至第7孔，最后，从第7孔中吸出100μL 弃去，使之体积均为100μL。第8孔为空白对照组。代测品孔中每孔各加入代测样品100μL。封孔膜封板，将反应板置37℃120min。用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，向滤纸上印干。每孔中加入第1抗体工作液50μL，封板，将反应板充分混匀后置37℃60min，用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，向滤纸上印干。每孔加酶标抗体工作液100μL。封板，将反应板充分混匀后置37℃60min，同前洗板。每孔加入底物工作液100μL，封板，置37℃暗处反应5～10min。每孔加入50μL终止液混匀。在492nm处测吸光度A值。

　　统计学处理： 数据采用±s表示，应用SPSS12.0统计软件进行单因素方差统计学分析。

　　2结果

　　牛眼小梁细胞原代培养3～12d细胞从组织块呈放射状爬出，原代细胞形态各异，呈圆形、多角形、星形、梭形等，细胞折光性强，胞质丰富，有多个树突，核圆，有1～2个核仁。细胞生长至一定数量时，细胞形态趋于一致呈扁平、较宽、多角形。传代细胞约24h贴壁，传至3代的小梁细胞具有稳定的形态结构，细胞胞质丰富，颗粒多，见胞突及分支，胞核卵圆形，多个核仁。融合后细胞呈扁平上皮样。透射电镜示,细胞有丰富的细胞器如线粒体、高尔基体、内质网和溶酶体以及丰富的微丝和微管等;核圆或卵圆，位于中央，核膜双层，有明显的边缘异染色，核仁大而明显。NSE染色阳性，表达vimentin,不表达Ⅷ：Ag，证实所培养小梁细胞的神经外胚层神经嵴间充质起源。综上所述，证明所培养的细胞是小梁细胞。

　　2.1AEA对牛眼小梁细胞细胞面积影响

　　相差显微镜及透射电镜下观察发现,随着AEA浓度的升高，牛眼小梁细胞突起减少，变圆且面积增加，细胞间隙扩大。 AEA作用后小梁网的细胞面积及PGE2吸光度A值的变化

　　2.2AEA对牛眼小梁细胞细胞产生PGE2的影响

　　AEA作用后，PGE2的A值呈剂量依赖性升高，细胞上清中的PGE2含量明显升高，与对照组有显著性差异(P<0.05)。

　　3讨论

　　根据化学结构的不同，可将大麻素分为4组。N花生四氢酸氨基乙醇(anandamide ,AEA)是其中的一种。目前已明确大麻素的受体有2种，它们分别为CB1受体和CB2受体。很多研究表明AEA可以降低眼压，而且还具有视神经保护作用，但是AEA的具体降眼压机制仍不是很清楚。AEA是1992年以色列的Raphael研究室首次从猪脑中提取出的一种内源性大麻素样物质。AEA是花生四烯酸的衍生物，它与CB1受体的亲和力要大于CB2受体[8]。Pate等[9]发现,用CB1受体拮抗剂SR141716A可以升高眼压，提示内源性大麻素对眼压可能存在着生理调节作用。大量研究已经证实CB1受体激动剂可以降低眼压。Stamer等[10]发现AEA存在于小梁网、睫状突及感觉神经视网膜组织中，人眼的睫状肌上皮、睫状肌、睫状体血管、角膜上皮、小梁网及Schlemm管均有CB1受体。对眼压有影响的睫状突与小梁网均存在CB1受体，说明AEA可以通过CB1受体对眼压起调节作用。

　　众所周知原发性开角型青光眼的眼压升高是由于房水外流通畅易度降低所致。房水外流的阻力主要来自小梁网紧贴Schlemm管内壁下方的部分(邻管区)。研究表明，小梁细胞的形态、收缩状态、细胞和细胞外基质及细胞之间的黏附性以及细胞骨架结构均参与房水外流的调节[11] ,并不同程度地影响眼压值的变化。细胞外基质的降解以及细胞间黏附性的下降会增加房水外流的通畅性[12] 。Stumpff等[13] 发现,应用CB1受体激动剂CP55，940可以引起牛眼小梁细胞剂量依赖性的收缩反应，且这种作用可以被CB1受体拮抗剂部分阻滞，大麻素的这种收缩效应推测可能由激活高导率钙离子耦联钾离子通道(BKCa)来实现的。我们通过相差显微镜及透射电镜下观察发现CB1受体激动剂AEA介导体外培养的牛眼小梁细胞，随着AEA浓度的升高，牛眼小梁细胞变圆，细胞突起减少，细胞间隙扩大，并成浓度依赖性。据此，我们推测，在小梁细胞中,AEA可能是通过控制肌动蛋白微丝细胞骨架,使细胞突起变少，进而影响细胞与细胞、细胞与细胞外基质的黏附性,引起细胞舒张、细胞分离和细胞形态改变,导致房水外流通畅性增加和眼压降低。

　　我们还发现，牛眼小梁细胞在AEA作用后，前列腺素PGE2的A值呈剂量依赖性升高，细胞上清中的PGE2含量明显升高，与对照组有显著性差异(P<0.05)。这说明AEA可促进牛眼小梁细胞表达PGE2。前列腺素衍生物在青光眼治疗中具有良好的降眼压效果[14]。前列腺素衍生物是通过增加巩膜—葡萄膜通道的房水外流而降低眼压的。其作用机制是前列腺素衍生物通过作用于睫状肌和巩膜—葡萄膜通道的基质金属蛋白酶(MMP)，造成睫状肌松弛，肌间隙增宽;同时MMP活性增加，也减少了房水外流的阻力，导致房水经巩膜—葡萄膜通道的外流增加和眼压的降低[15，16]。实验证实，吲哚美辛可以抑制AEA的降眼压作用，而吲哚美辛是一种环氧化酶抑制剂，可以抑制花生4—烯酸合成前列腺素[17]。另有研究发现，AEA可以诱导人眼非色素睫状体上皮细胞环氧化酶2(Cox2)和MMP的表达，提示AEA可能是通过这两种酶调节眼压的[18]。PGE2有4种受体，分别为EP1，EP2，EP3，EP4。现有研究发现，有些PGE2(如比马前列腺素及乌诺前列酮)也可能是通过作用于传统房水流出通道(小梁网通道)来降低眼压的[1924]，并且这种促进作用也可以被非甾体抗炎药所抑制[23,24]。

　　近代研究表明，视网膜神经节细胞(RGC)的慢性进行性丢失是青光眼最主要的病理学特征。现已明了，高眼压、缺血等原发性损伤因素首先引起一部分对高眼压敏感的RGC崩解死亡，这些崩解死亡的RGC可以释放出NO、谷氨酸等毒性物质，后者可刺激邻近已逃避原发病因的健康RGC表面的N甲基D天门冬氨酸(NMDA)受体，使之产生毒性反应，通过一系列信号传导使大量Ca2+流入RGC，使其进入凋亡程序而最终丢失。已有研究证实AEA以及其它内源性大麻素[2,25]可以阻滞NMDA诱导神经细胞内Ca2的聚集，起到神经保护作用,也可以阻滞NMDA诱导的视网膜神经毒性[26]，可以减少轴突变性和促进轴突的再生[27]。这些发现都有力地证明AEA对视神经有保护作用。也有文献报道PGE2也具有细胞保护作用[28]。

　　青光眼治疗的策略包括降低眼压，控制眼压波动，保护视神经。AEA可以降低眼压，保护视神经，因而有可能成为抗青光眼治疗的新药，但目前还有很多问题有待进一步研究。我们有理由相信随着对AEA的深入研究,有可能为寻找治疗青光眼的新药物提供一条新的途径。

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