RNA干扰在视网膜母细胞瘤治疗中的研究进展

　　作者：潘雪,李平华　　作者单位：中国重庆市，重庆医科大学附属第一医院眼科

　　【摘要】 RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近几年发展起来的一种新兴的基因沉默技术，它是由双链RNA介导的靶向基因序列特异性转录后沉默机制。目前，RNAi技术已被广泛应用于各种肿瘤研究。本文主要论述RNAi在视网膜母细胞瘤治疗方面的应用及进展。

　　【关键词】 RNA干扰;视网膜母细胞瘤;基因治疗

　　Research advance of RNA interference in the treatment of retinoblastoma

　　Xue Pan, PingHua Li

　　Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China

　　AbstractRNA interference (RNAi) is a new gene silencing technique, which is a posttranscriptional gene silencing mediated by double stranded RNA, resulting in the sequencespecific silence of target gene. RNAi technique has been applied widely in the research of various tumors. We reviewed the application and development of RNAi on the treatment of retinoblastoma.

　　KEYWORDS: RNA interference; retinoblastoma; genetic therapy

　　Pan X, Li PH. Research advance of RNA interference in the treatment of retinoblastoma. Int J Ophthalmol(Guoji Yanke Zazhi) 2008;8(11):23022304

　　0引言

　　视网膜母细胞瘤(retinoblastoma, RB)是婴幼儿最常见的眼内恶性肿瘤，在世界范围内估计每年可能有5000～8000新发病例[1,2]。我国的RB患儿一经确诊几乎全部行眼球摘除或眼眶内容物剜除术，这将导致患儿眼球及视功能的完全丧失，给患儿及其家人带来极大的痛苦。而放疗和化疗虽然对于RB有一定疗效，但可引起放射性的视网膜及视神经病变，亦可引起患儿出现第二肿瘤，因此迫切需要寻求新而有效的治疗方法。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近年来发展起来的一项新技术，能特异而有效的阻断靶基因的表达。RNAi操作的简单性和对靶基因表达抑制的高效性使其成为基因功能研究的有力手段，并可能选择性地抑制人类疾病相关基因的表达，在探查基因功能和治疗人类疾病方面有着广阔的应用前景。目前，RNAi技术已被广泛应用于各种肿瘤的研究中，为肿瘤的基因治疗带来新的希望。本文就近年来RNAi技术在视网膜母细胞瘤治疗方面的研究进展作一综述。

　　1 RNAi技术简介

　　内源性或外源性双链RNA(doublestranded RNA,dsRNA)在细胞内导致与其序列同源的mRNA分子发生特异性降解，从而干扰相应基因的表达，这种现象即为RNAi。1998年Fire等[3]在线虫的研究中发现，双链RNA可有效抑制目标基因的表达，他们称此现象为RNAi，两人因此获得了2006年诺贝尔医学(生理学)奖。随后，Elbashir等[4]在2001年首次应用长度为19～23个碱基对的双链小分子干扰RNA(small interference RNA,siRNA)成功地在哺乳动物中诱发了基因沉默，证实这些细胞也普遍存在RNAi机制，由此掀起了研究和应用RNAi技术的热潮。2002年Caplen等[5]提出有望用RNAi治疗某些特定基因表达过度引起的疾病，尤其用于抑制癌基因或突变基因引起的癌症的基因治疗当中。

　　虽然遗传学和生物化学的方法都已用于探索RNAi的机制，但其真正的机制尚未完全清楚。目前公认的RNAi作用机制为：外源性或内源性的dsRNA在细胞内与一种具有dsRNA 特异性的RNA酶Ⅲ内切核酸酶(RNAase III endonuclease)Dicer[6]结合为酶dsRNA复合物，随即被切割成21～23bp(base pairs)的RNA片段，即siRNA。siRNA带有3’端2nt突出[7]及磷酸化的5’端[8]，是RNAi 的起始诱导物。随后与核酸内外切酶、解旋酶及Argonaute蛋白等连接形成沉默复合体[9](RNA induced silencing complex,RISC)。RISC中的解旋酶应用ATP解开siRNA双链，使其反义链互补结合到靶向的信使RNA(messager RNA,mRNA)上与之相匹配的特异性序列，RISC中的核酸降解mRNA，降解的mRNA随后迅速地被细胞中其他的RNA酶所降解，从而使目的基因沉默，产生RNAi现象。

　　实验证实，siRNA可在多种器官包括肝、胰、脾、肾、视网膜、血液系统、神经系统、胚胎和造血干细胞等的细胞中抑制目标基因的表达[1012]。目前认为，RNAi的基本特征有：(1)高特异性：siRNA只与同源mRNA互补并使其降解，而其他的mRNA表达并不受影响，siRNA单个碱基的改变可能就会导致RNAi的失败。(2)高效性：微量的siRNA即可使其编码的致病基因产物的含量下降90%以上，达到高效敲除的效果，从而产生缺失突变体的表型。(3)转录后基因沉默：siRNA使基因在转录后沉默，转录前不受影响。(4)高穿透性：RNAi可在细胞间传递和维持，在线虫的干扰效应下可以遗传到后代中去。

　　2 RNAi技术在视网膜母细胞瘤治疗中的应用

　　视网膜母细胞瘤的发生是一个复杂的多阶段过程，其发病机制主要是各种环境因素与癌基因和抑癌基因的相互作用而导致癌基因活性增强和抑癌基因的失活。RNAi技术为视网膜母细胞瘤治疗的研究提供了新的策略和技术平台。

　　2.1 RNAi对VEGF的抑制 肿瘤内血管新生是肿瘤细胞得以不断分裂、生长和转移的基础，抑制新生血管生成使肿瘤组织在较长时间处于相对缺血的微环境中，从而达到治疗肿瘤的目的[13]。血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一个非常重要的促血管生成因子，在众多血管调控因子中，VEGF是唯一能特异作用于血管内皮细胞的有丝分裂素。它可刺激内皮细胞增生，直接或间接参与肿瘤血管生成的诸多环节，并可增加血管的通透性[14]。VEGF在RB组织内的高含量已被多项研究证实[15]。因此，以VEGF作为治疗靶点来治疗RB，将会有一定的效果。Wang等[16]利用RNAi技术在视网膜母细胞瘤细胞内诱导RNAi，抑制VEGF基因表达，研究发现VEGFsiRNA在体外能明显抑制视网膜母细胞瘤细胞增殖和VEGF基因的表达。Jia等[17，18]在人源性视网膜母细胞瘤细胞株SORb50和HXORb44中观察到了siRNA对VEGF的显著抑制效果，然后将SORB50接种到BALB/c裸鼠皮下建立起肿瘤模型，通过瘤体内注射抗VEGF的siRNA，隔天治疗一次。结果发现：这种瘤体内局部应用的siRNA同样也可显著地抑制肿瘤内的VEGF表达，肿瘤生长明显减慢。并且在治疗15d时，应用VEGFsiRNA的肿瘤体积较对照组减少了66%。上述研究证实siRNA可明显抑制RB血管新生和肿瘤生长，故靶向VEGF的RNAi可作为拮抗VEGF并治疗RB的有效手段。

　　2.2 RNAi对 survivin和cMyc的抑制 Survivin基因是近年来发现的凋亡抑制因子(inhibitor of apoptosis,tosis protein)家族中的新成员，它在发育中的胚胎、部分正常分化的成熟组织和多种肿瘤中高表达[19]。Survivin的过度表达，可以抑制内源性或外源性凋亡途径介导的细胞死亡。最近研究发现，几乎在所有实体瘤中都高表达的 survivin 基因亦参与肿瘤血管的生成。因此，用RNAi技术干扰 survivin

　　基因在肿瘤中的高表达，既能使肿瘤细胞凋亡，又能抑制肿瘤血管的生成，从而起到双重抗肿瘤作用[20]。王国军[21]的研究证实survivin蛋白在RB细胞中的表达明显高于正常眼组织，而这种高表达使得细胞易于通过细胞周期的检测点，抑制促凋亡因素，最终加速细胞的增生，以利于RB的发生。在体外细胞水平探讨靶向 survivin基因的RNAi对视网膜母细胞瘤细胞株HxoRB44凋亡的影响时发现含靶向 survivin的shRNA的重组真核质粒载体能够在视网膜母细胞瘤细胞株HxoRB44中稳定地表达，且能有效地抑制 survivin基因的表达，从而诱导RB细胞的凋亡及抑制瘤体增殖[22]。原癌基因 cMyc被认为是具有激活和抑制双重作用的转录调节因子，在细胞的增殖、分化和凋亡过程中发挥着重要作用。原癌基因 cMyc的高表达在肿瘤发生中很常见，其以转录因子的形式通过调节靶基因的表达，促进细胞增生，促使细胞从G0期进入G1期。同时有研究结果表明 survivin与cMyc蛋白表达有相关关系[22]。应用 survivin质粒转染人胚胎肾293细胞使其高表达Survivin蛋白，此时转染的肾细胞增生加快，对其 cMyc

　　基因的表达有显著的促进作用[23]。大肠腺癌细胞转染 survivin基因后，cMyc蛋白转录活性明显提高，进而可以增强端粒酶活性，延长细胞寿命[24]。有研究证实[23]

　　survivin、cMyc蛋白在RB细胞中的高表达及其协同作用在RB的生长中发挥着重要作用，通过靶向 survivin基因的RNAi在抑制 survivin基因表达的同时，也下调了 cMyc基因的表达，从而进一步促进RB细胞的凋亡。

　　2.3 RNAi对HPV的抑制 人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一种长约8kbp、无胞膜的双链闭环DNA病毒。现已发现HPV与全身许多部位的黏膜和皮肤上皮良、恶性肿瘤发生有关。目前认为HPV致癌机制主要与HPV E6和E7蛋白参与病毒复制、使受感染细胞无限增殖和恶性转化有关。E6蛋白可结合并降解P53蛋白使细胞周期失控或基因突变[25]。E7蛋白可与RB蛋白(pRB)结合使其磷酸化失活，释放核转录因子E2F产生多种转录因子使细胞从G1期向S期转化导致细胞无限增殖[26]。近年来研究表明，HPV也可能参与RB的发生[27]。Orjuela等[27]发现HPVDNA的存在与pRB有关，尽管差别未达到统计学意义。但动物实验发现表达高危型HPV16 E6和 E7的

　　转基因小鼠可以发展成RB。因此Orjuela等[27]提出HPV可能是散发性RB的发生机制之一。近几年，siRNA经常作为一种特异而高效的基因工具而应用于HPV的相关研究中。Yamato等[28]研究表明HPV16 E6、 E7siRNA能明显抑制宫颈癌癌细胞HPV16 E6、 E7基因的表达，增加细胞内肿瘤抑制因子P53、P21蛋白的水平，从而可诱导肿瘤细胞凋亡。Yoshinouchi等[29]在体外和裸鼠体内均进行了siRNA抑制HPV16 E6的研究，他们发现siRNA可使哺乳动物细胞COS1中HPV16 E6水平呈剂量依赖性降低，同时他们的研究证实转染了HPV16 E63 siRNA的宫颈癌SiHa细胞形成的肿瘤明显小于对照组。虽然现在尚无明确研究证实通过RNAi技术抑制 HPV基因的表达可抑制RB的增殖，但也为其研究提供了新的方向。

　　2.4 RNAi增强 Rb基因的表达 Rb基因是第一个被确证的抑癌基因,也是肿瘤的基因治疗中研究的最为深入的抑癌基因之一，其主要作用是控制细胞的增生和分化，将 Rb

　　基因导入 Rb基因缺失的肿瘤中，可选择性地导致肿瘤细胞不可逆转的生长停滞，并激活端粒酶，而对正常的体细胞没有副作用。分子遗传学的研究证明，Rb基因是与RB形成关系最为密切的基因，Rb基因经两次突变而失活被公认为是RB发生的重要分子机制。Rb基因的活力是通过磷酸化和乙酰化作用来调节的，Wong等[30]的研究证实过度表达的 SIRT1基因可使 Rb基因的乙酰化明显减少，而利用RNAi可使 SIRT1基因表达降低从而产生大量乙酰化的 Rb

　　基因以抑制肿瘤的生长。Yang等[31]采用RNAi技术对乳腺癌细胞MCF7细胞 BRCAA1基因(乳腺癌抗原相关基因)进行特异性抑制，结果示 Rb基因表达较之阴性对照组上升了11.1%，实验组MCF7细胞增殖抑制率为(81.9±6.1)%，抑制作用明显强于对照组，因此利用siRNA干扰

　　BRCAA1基因可明显增强 Rb基因表达从而抑制MCF7细胞的增殖。上述研究结果表明通过RNA干扰抑制 SIRT1基因和 BRCAA1基因等的表达可使RB蛋白表达明显增强，从而可能增强对肿瘤的抑制能力，但通过RNAi可增强视网膜母细胞瘤中RB蛋白尚无明确实验证实，还有待进一步研究。

　　3问题和展望

　　由于眼部的特殊组织结构，一直作为基因治疗理想的靶器官。眼是一个相对隔离的组织空间，在眼局部应用siRNA可避免其与身体其他部位的直接接触，同时也可相应的减少siRNA的用量。有研究发现[32]，将siRNA注射于玻璃体中很快就在眼组织内扩散开，并且直到注射后5d仍能检测到siRNA的表达，等到siRNA扩散出眼组织之外时，它已经被高度稀释，很难再对其他组织的同一基因发挥效应，这样它对身体其他组织基因的作用微乎其微。相对于系统的应用siRNA来说，眼组织的这种特点使得在眼部应用RNAi治疗可以有效的沉默眼部基因，从而避免对身体其他部位同种基因的“远达效应”，这种缘于siRNA序列特异性和眼组织相对独立性的局部siRNA应用，为研究眼组织局部“基因敲除”提供了便利的途径。尽管RNAi在研究基因功能、基因治疗中表现出相当的优越性，但是仍然有很多问题亟待解决。如RNAi具体的分子机制，如何确定有效RNAi的位点，如何高效导入siRNA，怎样保证导入siRNA的稳定性，如何有效延长RNAi的作用时间，各类表达载体及合成RNA的毒副作用等。然而，RNAi独特的作用机制及其简便的操作流程和对靶基因表达抑制的高效性使其在肿瘤基因治疗方面显示出了广阔的应用前景。相信随着研究的广泛细致深入，越来越多的与肿瘤生长增殖密切相关的高特异性靶基因及能使外源性治疗基因高效表达载体的发现，RNAi技术将可能成为视网膜母细胞瘤基因治疗的一种新手段。

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