内源性大麻素AEA对体外培养的牛眼小梁细胞形态和细胞骨架的影响

　　作者：孙松林,张德秀,郭波霞　　作者单位：中国陕西省西安市，西安交通大学第一附属医院眼科;(030003)中国山西省运城市中心医院眼科

　　【摘要】 目的：研究内源性大麻素(AEA)对体外培养牛眼小梁细胞形态和细胞骨架的影响，探讨大麻素在原发性开角性青光眼(POAG)中的降眼压的机制，为大麻素的眼部用药提供帮助。

　　方法：原代培养的牛眼小梁细胞，经不同质量浓度的AEA作用后，于光学显微镜下观察小梁细胞形态的改变，免疫荧光染色后在荧光显微镜下观察肌动蛋白微丝束的形态改变。免疫组化(SABC法) 对atubulin(微管蛋白)染色，结果以计算机图像分析系统分析, 并统计学检验。

　　结果：经AEA作用后的牛眼小梁细胞，细胞间隙扩大,细胞变圆,细胞立体感增强;肌动蛋白微丝纤维变稀疏,断裂，排列紊乱。各浓度组与对照组比较，微管蛋白的含量减少，其下调呈浓度依赖性。

　　结论：大麻素可改变体外培养的小梁细胞的形态和细胞骨架，引起细胞内的微管蛋白含量的减少，有利于降低小梁网房水引流阻力。

　　【关键词】 小梁网细胞;内源性大麻素;细胞形态;肌动蛋白微丝;微管蛋白;POAG

　　Effect of endogenous AEA on the morphology and cytoskeleton of bovine trabecular meshwork cells cultured in vitro

　　SongLin Sun, DeXiu Zhang, BoXia Guo

　　Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Medical College, Xian Jiaotong University, Xian 710061, Shaanxi Province, China; Yunchen Central Hospital, Yunchen 030003, Shanxi Province, China

　　Abstract

　　　AIM: To study the effect of endogenous AEA on the morphology and cytoskeleton of bovine trabecular meshwork cells cultured in vitro, and to investigate the mechanism of AEA lowering eye pressure in primary openangle glaucoma (POAG), in order to provide help in AEA medication in ocular region.

　　　METHODS: Primarily cultured bovine trabecular meshwork cells, after treated by different mass concentration AEA, were observed under light microscope to detect cell morphology changes and under fluorescence microscope, after immunofluorescence stain,to detect actin microfilament bundle changes. Immunohistochemical method (SABC) stained atubulinthe and the results were analyzed by computer image analysis system and statistically tested.

　　　RESULTS: After AEA treatment, bovine trabecular meshwork cell spaces increased, with more rounded and stereoscopic morphology, actin filaments became sparse, disrupted and abnormally aligned. Comparing all concentration groups with control group, microtubulin content was decreased in concentration dependent fashion.

　　　CONCLUSION: Certain mass concentration of AEA may change the morphology and cytoskeleton of trabecular meshwork cells culturedin vitro, induce the decrease of cell microtubulin content, in favor of lowering aqueous fluid drainage resistance in trabecular meshwork.

　　　KEYWORDS: trabecular meshwork cells; endogenous AEA; cells morphology; actin filaments; atubulin; POAG

　　0引言

　　原发性开角型青光眼是全世界主要致盲疾病之一, 迄今为止, 其病因及发病机制尚不清楚。现已证明, 原发性开角型青光眼的眼压升高是由于房水排出通道的病变, 使房水排出阻力增加所致。房水流出通道大部分衬覆有小梁细胞, 研究证明小梁细胞具有多种功能, 诸如吞噬、收缩、合成及分解糖蛋白, 产生前列腺素等生物活性物质, 这些功能使得小梁细胞在房水排出的生理和病理过程中具有重要影响[1]，而小梁细胞的这些功能活动均以细胞骨架为基础。大麻素是一种众所周知的影响精神活动的物质，又是一种具有潜在医用价值的药物，已有很多实验证实大麻素可以降低眼压。目前研究最多的内源性大麻素是花生四氢酸氨基乙醇(anandamine，AEA)和2花生四稀酸甘油(2arachidonoylglycerol， 2AG)。

　　与AEA使细胞密度降低,间隙扩大;细胞变圆,突起减少,且随浓度的增加变化越来越明显(相差显微镜 ×200)

　　A:对照组;B:10 7mol/L; C:10 6mol/L , D:10 5mol/L

　　1材料和方法

　　1.1材料 取屠宰场新杀小牛牛眼, 4℃冰桶运回实验室,处死后2 h内取材。高糖型DMEM培养基购自Gibco公司,胎牛血清购自杭州四季青生物工程公司。神经元特异性烯醇化酶(NSE) 、波形蛋白( vimentin)及Ⅷ因子相关抗原( ⅧR: Ag)mAb由第四军医大学病理教研室提供。Alexa488标记的鬼笔环肽(Alexaphalloidin ,美国Sigma 公司产品) 。羊抗兔atubulin及相关试剂盒购自华美公司。Zoom2000 型解剖显微镜(德国Leica 公司产品) , CO2 培养箱(美国Napco 公司产品) ,倒置相差显微镜和荧光显微镜(均为日本Olympus 公司产品)。

　　1.2方法 采用组织块培养法培养小梁网细胞。小梁网细胞游离出组织块后,每周换液1～2次。待细胞长满瓶底后,消化传代。取第3代牛小梁网细胞接种于预置盖玻片的培养皿中,待细胞贴壁2d后用40g/L多聚甲醛固定,行NSE，vimentin及ⅧR: Ag免疫组织化学染色。在预置盖薄片的24孔板内,用同一细胞系细胞,以2×104个/孔接种密度制作细胞爬片,待细胞生长至基本汇合时,血清饥饿过夜。实验细胞分成4组:对照组，浓度分别为107mol/L,10 6mol/L , 10 5mol/L 的AEA3组.每组6孔板,各组均在无血清DMEM37℃、50mL/L CO2 培养箱孵育24h。同一细胞爬片,不同条件作用后标记,迅速置于倒置相差显微镜下,同一部位观察、照相。取其中的12张标本,每组3张,用冰PBS 迅速冲洗各组细胞爬片3 次20g/L多聚甲醛固定20min ;PBS充分冲洗后,加入1.2g/L Triton X—100 反应5min ; PBS冲洗3 次,以PBS 稀释的Alexa488标记的鬼笔环肽避光作用1h;用含Triton X—100 的PBS 冲洗3 次,600g/L甘油封片。荧光显微镜下观察肌动蛋白细胞骨架。另取不同组别共12张标本，每组3张，进行免疫组化染色，具体方法见参考文献[2]。然后标本行计算机图象分析，计算微管蛋白的灰度值。

　　统计学处理：采用SPSS10.0统计软件进行分析，以±s表示，组间比较用t检验。

　　2结果

　　2.1小梁细胞形态 牛眼小梁细胞原代培养5～12d后细胞从组织块向外生长,细胞轮廓清,形态各异, 2wk左右细胞围绕组织块周围形成单细胞层。融合后细胞轮廓欠清,以上皮型为主。传至第3代的小梁网细胞有稳定的形态结构,可见胞突和分支。透射电镜见细胞胞质丰富,微丝于双层核膜周围可见,核仁明显。NSE染色阳性, ⅧR: Ag染色阴性, vimentin染色阳性,证实了小梁细胞的神经外胚层神经嵴间充质来源[3] 。相差显微镜下观察,经AEA作用后的牛眼小梁细胞变圆,突起减少，细胞间连接受到破坏,面积增大，立体感增强, 细胞间隙扩大, 细胞容易从爬片上脱落，并且随着AEA浓度的增加，这些变化越来越明显。

　　2.2小梁细胞细胞骨架 荧光显微镜下观察,对照组的肌动蛋白纤维清晰可见，呈细丝状，沿着细胞的长轴分布。相对于对照组，AEA组的肌动蛋白纤维断裂变短;排列紊乱，稀疏，发生弯曲。尤其以浓度组105mol/L的变化为明显。提示肌动蛋白微丝的聚合状态发生改变。

　　2.3小梁细胞微管蛋白含量 各浓度组与对照组的a微管蛋白含量比较, 差异均有显著性( P<0.01);随着浓度的升高,各组的含量依次减少( 灰度值分别为186.25±15.84，170.30±7.88，132.70±10.35，110.67±15.20，P<0.05)。说明其减少呈浓度依赖性。

　　EA使肌动蛋白纤维变稀,排列紊乱，断裂,弯曲(荧光显微镜 ×800)

　　A:对照组;B:10 7mol/L; C: 10 6mol/L; D:10 5mol/L

　　3讨论

　　细胞骨架主要由微丝、微管和粗细介于两者之间的中间纤维组成。小梁网房水流出通道上的各种细胞均含有大量的微丝、微管和中间纤维，特别是小梁细胞和Schlemm管内皮细胞。微丝由收缩蛋白(肌动蛋白和肌球蛋白)、连接蛋白(α捕肌动蛋白和纽带蛋白)和调节蛋白(原肌球蛋白和钙调节蛋白)3种蛋白组成;主要存在于细胞质中,从核膜向周围分布或沿质膜分布,呈网状。在肌肉和非肌肉细胞中微丝是参与细胞结构和收缩功能的重要成分。微管是由α管蛋白、β管蛋白和少许微管结合蛋白组成;存在于细胞肌质内，组成中心粒、纤毛或绒毛等。微管参与维持细胞形态、有丝分裂、轴浆运输等多种功能。中等纤维由5种蛋白组成:角质纤维蛋白、波形纤维蛋白、结蛋白、胶原纤维酸性蛋白和神经纤维蛋白;它位于细胞核膜周围,与核内骨架相连。中等纤维在细胞的形态与维持、胞内支撑、细胞的位移和铺展、胞内颗粒的运动、细胞之间的连接,细胞器和细胞核的定位等方面起着重要作用。小梁细胞内细胞骨架成分丰富而明显。小梁细胞具有一定的收缩功能，细胞骨架的含量及成分对小梁细胞形态和收缩极为重要,细胞骨架含量、成分改变及质量异常等均可使小梁网细胞形态发生改变，从而影响小梁网的收缩和伸展,影响小梁网的网眼大小,影响房水的流出[4]。

　　我们选择细胞骨架中最重要的两个结构微丝和微管作为研究指标。从对以往文献的研究，我们得知肌动蛋白微丝的形态及其可能的变化都具特殊性，因此我们侧重于研究其形态变化。而a微管蛋白形态的可能变化不明显，因此我们侧重于研究其量的变化。大麻素的主要受体有2种：CB1受体和 CB2 受体[5,6]。Stamer等[7]在牛及人眼的睫状突和小梁网中证实了CB1mRNA及其蛋白的存在。对眼内压有影响的睫状突与小梁网均存在CB1受体，说明大麻素可以通过CB1受体对眼内压起调节作用。

　　本研究结果显示，通过一定质量浓度的AEA作用后，牛眼小梁细胞肌动蛋白纤维断裂变短;排列紊乱，稀疏。α微管蛋白的量呈浓度依赖性降低。细胞间隙扩大, 细胞容易从爬片上脱落，细胞变圆,突起减少,细胞间连接受到破坏。提示AEA可能通过破坏细胞骨架而降低细胞间、细胞与细胞外基质的黏附性,造成细胞分离和小梁细胞的丢失;可能通过改变肌动蛋白微丝的聚合状态及微管的量，引起细胞舒张,改变细胞形态。

　　AEA 降低眼压的可能机制:肌动蛋白细胞骨架结构能影响细胞形态,改变外流通路松弛度和引流路径,影响房水外流阻力[8] 。既往关于肌动蛋白降解剂降眼压的研究证实了这一点。例如，一些直接或间接的肌动蛋白裂解物质,如丝氨酸 苏氨酸激酶抑制剂H7 和latrunculinA/B 均可有效地降低眼压增加房水流出易度[ 9,10],组织学研究表明, H7可使小梁组织形态和结构改变,如细胞松弛、近管旁区域扩展、Schlemm管扩张和内壁前突而减少房水流出阻力[11]。细胞骨架也可以影响细胞与细胞间连接、细胞与细胞外基质的黏附作用,引起细胞信号传导改变,而影响房水外流[12,13] 。细胞外基质的降解以及细胞间黏附性的下降也会增加房水外流的通畅性,有降低眼压的作用[14]。根据本实验结果，我们推测在小梁细胞中, AEA通过降低细胞与细胞外基质黏附性,增加细胞的丢失量;改变肌动蛋白微丝细胞骨架,使细胞舒张变圆;从而扩大细胞间隙,增加房水外流的通畅性，降低眼压。

　　大麻素降眼压的具体机制目前还不清楚。最近的研究显示CB1受体在大麻素的降眼压中有重要的作用[1517]。Lograno等[18]发现AEA和CP55，940可能是由CB1受体激活G偶联蛋白信号途径发动的，通过磷脂酶C介导而增强牛眼睫状肌的收缩。睫状肌的收缩可引起小梁网的被动扩张使房水流出通道加宽，从而降低眼压。Zhou等[19]发现大麻素可通过CB1受体，依赖cAMP途径而改变细胞的形态和细胞骨架。Stamer等[20]发现大麻素在体外试验中可以激活异源三聚体G蛋白和导致cAMP的聚集。由此我们可以推测AEA可能是由CB1受体激活G偶联蛋白信号途径发动的，通过cAMP途径把信号传向胞内肌动蛋白微丝，通过肌动蛋白微丝的组装、重组以及将信号向更深入的方向传递,引起胞浆pH值、钙离子浓度、蛋白磷酸化以及基因诱导等一系列改变, 从而实现细胞移动、黏附及形态变化等。通过本试验，我们认为作为影响细胞骨架药物的大麻素可改变细胞形态，破坏细胞间的连续性，利于房水外流，而降低眼压。但其引起眼压下降的具体机制到目前为止并不清楚，需要我们进一步探索。

　　【参考文献】

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