青光安颗粒对兔急性高眼压视神经轴突的保护作用

　　作者：赵海滨,彭清华,吴权龙,曾志成　　作者单位：(410007)中国湖南省长沙市，湖南中医药大学第一附属医院眼科学重点学科;(421001)中国湖南省衡阳市，南华大学第一附属医院眼科

　【摘要】 目的：观察青光安颗粒对兔急性高眼压状态后视神经轴突及视网膜神经节细胞的保护作用。方法：家兔48只随机分成青光安治疗组、模型对照组，每组24只。用生理盐水灌注法1眼造成急性高眼压模型，另1眼则穿刺灌注不加压作为自身空白对照组，连续灌胃14d。分别于造模后7，14d处死，检测视网膜中NO及谷氨酸的含量，并观察视网膜的病理组织学改变。结果：7d后各组视网膜组织中NO、谷氨酸含量比较差异有显著性(P<0.01)，治疗组和模型组中NO及谷氨酸含量均高于空白组，差异具有显著性(P<0.01，P<0.05)，但治疗组明显低于模型组，差异亦具有显著性(P<0.01)。14d后治疗组中NO及谷氨酸含量均接近空白组，差异无显著性;但模型组仍明显高于空白组，差异具有显著性(P<0.05，P<0.01)。治疗组与模型组两组2wk之间比较差异均有显著性(P<0.05)。电镜结果表明，与模型组对比治疗组轴突肿胀较轻，轴浆内线粒体清晰数目较多，视网膜神经节细胞损伤较轻。 结论：青光安能加速急性高眼压状态后视网膜组织中NO及谷氨酸的清除,对视神经轴突有保护性作用。

　　【关键词】 青光安颗粒;急性高眼压;一氧化氮;谷氨酸

　　Experimental study on the protective effects of qingguangan granule on optic nerve axons in rabbit eyes with acute ocular hypertension

　　HaiBin Zhao，QingHua Peng，QuanLong Wu，ZhiCheng Zeng

　　Foundation items: Scientific Research Foundation of Key Project of Education Office of Hunan Province, China(NO. 06A052); Scientific Research Foundation of Key Project of Health Office of Hunan Province, China(NO. 204084)

　　Key Discipline of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410007, Hunan Province, China; Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Nanhua University, Hengyang 421001, Hunan Province, China

　　Abstract

　　　AIM: To observe the protective effects of qingguangan granule(QGAG) on optic nerve axons and retinal ganglion cells in rabbit eyes with acute ocular hypertension.

　　METHODS：Fourtyeight rabbits were divided into two groups: treatment group and control group(24 in each). The acute ocular hypertension(60mmHg) models were established by forcing perfusion of normal saline solution into the anterior chamber, the other eye in experimental group which was maintained at basic intraocular pressure by the same method was regarded as normal control. The stomach in each group was irrigated for 14 days. The rabbits were killed 7 and 14 days after modeling respectively. The levels of the glutamic acid and NO in retina was measured, and the pathologic changes were observed.

　　　RESULTS： After 7 days, the glutamic acid and NO levels had significant difference between each group (P<0.01), and the levels in the treatment group and experimental group were significantly higher than that in normal control group; the differences were significant (P<0.05,P<0.01). But that in the treatment group was significantly lower than those in experimental group(P<0.01). After 14 days, the glutamic acid and NO levels in treatment group were close to that of the normal control group. However, the levels in the experimental group were significantly higher than those in normal control group (P<0.05,P<0.01). There were significant differences in two weeks between the treatment group and experimental group (P<0.05). Electron microscope result indicated that,for treatment group, optic nerve axons swelled less gently, mitochondria in optic nerve axons was clear and more, and the degree of damaged retina ganglion cells was lower compared with experimental group.

　　　CONCLUSION： QGAG can ameliorate retina microcirculation, promote the axoplasmic transport of optic nerve, accelerate NO and glutaminic acid removal in rabbits retina with acute ocular hypertension. It has the protective function for the optic nerve axons and the retinal ganglion cells.

　　　KEYWORDS：qingguangan Granule; acute ocular hypertension; nitric oxide; glutamic acid

　　0引言

　　青光眼是由于眼内压超过了眼球内部组织，特别是视神经所能承受的限度，引起视神经损害和视野缺损，严重危害视功能的常见眼病。以往其治疗常集中在降低眼内压方面，许多青光眼患者即使眼压已降至正常，患者的视野仍继续损害，表明单纯用眼压不能够解释青光眼的视神经损害，可能还存在一些其它危险因素[1]。国内外研究显示[24],青光眼视神经损害可被认为是由原发致病因素引起相关组织一系列生化反应，产生了大量可以损害自身的毒性物质，从而导致即使原发因素去除后视神经仍继续损害。而NO、兴奋性谷氨酸等可能是导致并参与视神经损害的重要递质。我们对兔急性高眼压模型服用益气活血利水功效的中药复方青光安颗粒后的各项指标的观测，进一步阐明青光安对兔急性高眼压视神经节细胞、轴突保护作用，并探明该药的具体作用机制。

　　1材料和方法

　　1.1材料 青光安颗粒由湖南中医药大学第一附属医院药剂科制备。使用时用温开水配制成浓度为300g/L的混悬液。一氧化氮试剂盒(酶法)：由晶美生物工程(北京)有限公司提供。Schiotz眼压计，由苏州医疗器械厂生产。H600透射电镜(日本日立仪器公司生产)。日本岛津LC6A高效液相色谱仪(岛津仪器有限公司生产)。

　　1.2方法 健康成年日本大耳兔48只，雌雄不限，体质量1.5～2.0kg，由湖南中医药大学动物实验中心提供。实验前检查双眼前节和眼底正常，眼压正常。急性高眼压模型造模方法参照赵桂秋等[5]用前房内生理盐水灌注法造模法，随机取1眼造模，于造模前3d予2.5g/L氯霉素滴眼液滴眼，3次/d;造模时用固定盒固定兔，清洁结膜囊后，用乌拉坦以4mL/kg，从兔耳缘静脉注射麻醉，以后每隔30min静注1mL/kg维持麻醉;10g/L地卡因表面麻醉后，用Schiotz眼压计测基础眼压为10～21mmHg，取412头皮针输液器连接一盐水瓶，瓶内盛无菌盐水，于左眼3∶00或右眼9∶00方位行前房穿剌，固定后升高盐水瓶至眼压为60mmHg，持续2h后缓慢降低液平面后拔去穿剌针，轻压针孔片刻，涂四环素眼膏。将48只兔完全随机分为2组，即青光安治疗组24只,模型对照组24只。治疗组和模型组均用上述造模方法，随机取1眼造成急性高眼压模型;模型组的另1眼则作穿刺灌注不加压，作为自身对照眼(空白对照组)。治疗组兔用青光安颗粒混悬液灌胃5mL/kg (相当于成人等效剂量);模型组兔用5mL/kg蒸馏水灌胃。均于造模前30min灌胃，1次/d，持续14d。 造模过程中，治疗组和模型组各有1只兔因麻醉过深死亡。分别于造模后7，14d用空气栓塞法随机分别处死模型组与治疗组各12兔。动物处死后立即标记角膜缘方位并摘除治疗组兔模型眼眼球及模型组双眼眼球。在冰上用眼科剪沿角膜缘剪开眼球后,去除晶状体,玻璃体,各组分别取2只眼球约2mm×2mm大小过视神经的全层眼球壁,立即置于25g/L戊二醛溶液中固定,4℃冰箱保存以作电镜用。再将余下的取颞侧(右眼9∶00,左眼3∶00)距视神经2mm处1cm×1cm的全层球壁块,立即置于100g/L甲醛溶液中固定,4℃冰箱保存以作光镜用。余皆将视网膜剥取出来,用冰生理盐水洗净残留血迹,并用滤纸吸干表面水分称重,以湿重按1∶20用冰生理盐水(待测NO)或无水乙醇(待测谷氨酸)稀释,并用玻璃匀浆器于冰水中匀浆。组织匀浆液(待测NO)，10000r/min离心10min，取上清液，沸水浴3min，10000r/min离心5min，取上清液0.1mL，20℃冰箱保存待测。组织匀浆液(待测谷氨酸)，4℃，15000r/min离心30min，取上清液，20℃冰箱保存待测。

　　1.2.1 NO的定量检测 采用一氧化氮酶法测定。取上清液0.1mL作检测，按NO操作法分别在测定管及标准管加入各试剂量或样品量。轻轻混匀，37℃恒温水浴1h后，加入显色剂混匀，室温放置10min后，用721分光光度仪在波长530nm处，0.5cm比色杯，空白管调零，分别读取测定管和标准管OD值。按公式计算出组织中NO的含量。

　　1.2.2谷氨酸定量检测 采用邻苯二甲醛柱前衍生法，高效液相色谱仪与荧光光度检测器测定样品中的氨基酸。通过标准品的测定，采用外算法根据氨基酸的色谱峰面积计算样品中的谷氨酸含量。

　　1.2.3光镜观察 将100g/L甲醛溶液固定的眼球标本作光镜送检，石蜡包埋，过视神经间断连续切片厚约为5μm，HE染色，光学显微镜观察并显微摄像。

　　1.2.4电镜观察 将25g/L戊二醛溶液固定的眼球壁标本作电镜送检，10g/L饿酸后固定1h,梯度丙酮脱水,EPON812环氧树脂浸泡,包埋,切成超薄片,醋酸双氧钠柠檬酸铅电子染色后做透射电镜观察,显微摄像。

　　统计学分析：多组比较用F检验，同组不同时间比较用t检验，多组间两两比较用q检验。用SPSS 12.0进行统计学分析。

　　2结果

　　2.1视网膜中NO的含量 急性高眼压状态后，兔视网膜中NO的含量升高。7d 3组之间比较差异有极显著性(P<0.01)。治疗组与模型组之间差异有显著性(P<0.01)，治疗组与空白组之间差异有显著性(P<0.01)，模型组与空白组之间差异有极显著性(P<0.01)。14d 3组之间差异有显著性(P<0.05)。治疗组与模型组之间差异有显著性(P<0.05)，治疗组与空白组之间差异无显著性，模型组与空白组之间差异有显著性(P<0.05)。治疗组与模型组两组2wk之间比较差异有显著性(P<0.05)。治疗组与模型组视网膜中NO含量在第2wk均明显下降，但以治疗组恢复得更快，已接近空白组水平。

　　2.2视网膜中谷氨酸的含量 急性高眼压状态后，兔视网膜中谷氨酸的含量升高。7d各组间比较差异有极显著性(P<0.01)。治疗组与模型组之间差异有极显著性(P<0.01)，治疗组与空白组之间差异有显著性(P<0.05)，模型组与空白组之间差异有极显著性(P<0.01)。14d 3组之间视网膜中谷氨酸含量差异有极显著性(P<0.01)。治疗组与模型组之间差异有极显著性(P<0.01)，治疗组与空白组之间差异无显著性，模型组与空白组之间差异有显著性(P<0.01)。治疗组7d与14d视网膜中谷氨酸的含量之间比较(P<0.05)，模型组之间比较(P<0.01)。造模后视网膜中谷氨酸含量明显升高，但随着时间的推移其含量逐渐下降，至第14d治疗组已到正常水平，模型组仍显著高于空白组。

　 2.3组织学变化 空白组视网膜各层结构排列整齐，神经节细胞核仁清晰可见，双极细胞核清晰，密度均匀，视锥、视杆细胞层胞核染色较深，层次分明。高眼压7d后，模型组可见视网膜各层结构不清，排列紊乱，节细胞数目明显减少，空泡样变，双极细胞、视锥细胞、视杆细胞疏密不一。治疗组可见视网膜各层结构稍紊乱，节细胞排列松散，偶见空泡样变,节细胞数目明显较模型组多。高眼压14d后，模型组可见视网膜各层细胞减少，排列不齐，节细胞数目较前增加，个别空泡样变。治疗组可见视网膜各层结构清楚，节细胞数目多且排列较齐，结构基本恢复正常。

　　2.4超微结构变化 空白组视神经髓鞘完整，轴浆均匀,轴浆内可见线粒体，线粒体结构清晰，神经节细胞胞质内线粒体结构清楚，嵴清晰可见，神经纤维层结构正常。高眼压7d后,模型组视神经多数轴突极度肿胀，板层结构变薄，部分有断裂，轴浆内结构呈絮状变性，线粒体数目减少，部分空泡化;神经节细胞明显水肿、固缩，胞质内线粒体肿胀、嵴部分丢失，空泡化，内质网扩张呈小泡状，神经纤维层结构疏松。治疗组兔眼视神经部分轴突肿胀，线粒体肿胀较模型组轻，可见部分线粒体嵴;神经节细胞内有少许空泡，显示轻度水肿，内质网有轻度扩张，核染色质分布均匀;神经纤维板层结构大多正常。高眼压14d后，模型组兔眼视神经轴突部分仍水肿，少数轴突髓鞘结构部分脱失，轴索轻度变性。轴浆电子密度增高，絮状变性明显减少，结构仍未恢复正常。治疗组轴突无肿胀，髓鞘排列整齐，层次清楚，轴浆电子密度高，线粒体数量增多、结构清晰，大部结构接近正常。

　　3讨论

　　青光眼视神经损害的病理基础是视网膜神经节细胞及其纤维的丧失，其机制是由于青光眼视神经的原发损伤激发了细胞内或细胞外的自我损伤过程，从而导致视神经的进一步损伤[6]。青光安颗粒中黄芪补气利水，生地养血滋阴，茯苓、车前子益气利水明目，地龙、赤芍、红花活血化瘀，共奏益气活血利水的作用。青光安颗粒的前期研究表明[7，8]，青光安能明显改善眼局部微循环，提高视网膜、视神经等眼内组织的耐氧、抗损伤功能。研究表明，兔急性高眼压状态后视网膜组织中NO及谷氨酸的过量释放，而谷氨酸作为一种兴奋性视神经递质，它的过量释放可作用于NMDA受体引起Ca2+过多内流，并使突触后细胞不能调节细胞内Ca2+，导致细胞内Ca2+过载，Ca2+同钙调素结合一起激活NOS，产生NO，而NO作为一种短效化合物能通过被动转运很快的离开细胞，NO作为自由基可致细胞膜脂质过氧化，细胞核DNA断裂，从而使神经节细胞损伤和调亡。青光安颗粒能明显抑制急性高眼压状态后视网膜组织中NO及谷氨酸的过量释放，并加速其在视网膜组织中的清除，拮抗NMDA受体与谷氨酸的结合，减轻因NO及谷氨酸过量释放造成的视网膜组织损害。与模型组比较，视网膜组织中NO、谷氨酸含量的差异具有显著性(P<0.01)。14d后治疗组中NO及谷氨酸含量均接近空白组，基本恢复正常差异无显著性，但模型组仍明显高于空白组，差异具有显著性(P<0.05)。青光安颗粒通过改善眼局部微循环，减轻视神经轴突因高眼压造成的机械性损伤，而导致其轴浆运输的双向阻滞，促使轴浆流中的神经营养因子的运输，从而使濒临变性、死亡的轴突得到最大限度的恢复，起到保护视神经的作用。光镜下观察结果示，高眼压7d后，模型组可见视网膜各层结构不清，排列紊乱，节细胞数目明显减少，空泡样变，双极细胞、视锥细胞、视杆细胞疏密不一;治疗组可见视网膜各层结构稍紊乱，节细胞排列松散，偶见空泡样变,节细胞数目明显较模型组多。高眼压14d后，模型组可见视网膜各层细胞减少，排列不齐，节细胞数目较前增加，个别空泡样变;治疗组可见视网膜各层结构清楚，节细胞数目多、且排列较齐，结构基本恢复正常。电镜下观察结果示，高眼压7d后,模型组视神经多数轴突极度肿胀，板层结构变薄，部分有断裂，轴浆内结构呈絮状变性，线粒体数目减少，部分空泡化;神经节细胞明显水肿、固缩，胞质内线粒体肿胀、嵴部分丢失，空泡化，内质网扩张呈小泡状，神经纤维层结构疏松。治疗组兔眼视神经部分轴突肿胀，线粒体肿胀较模型组轻，可见部分线粒体嵴;神经节细胞内有少许空泡，显示轻度水肿，内质网有轻度扩张，核染色质分布均匀;神经纤维板层结构大多正常。高眼压14d后，模型组兔眼视神经轴突部分仍水肿，少数轴突髓鞘结构部分脱失，轴索轻度变性。轴浆电子密度增高，絮状变性明显减少，结构仍未恢复正常。治疗组轴突无肿胀，髓鞘排列整齐，层次清楚，轴浆电子密度高，线粒体数量增多、结构清晰，大部结构接近正常。综上所述，青光安颗粒能改善视网膜微循环，促进轴浆传输阻滞的恢复，加速急性高眼压状态后视网膜组织中NO及谷氨酸的清除,对视神经轴突、视网膜神经节细胞有保护作用。

　　【参考文献】

　　1 Schwartz M, Belkin M, Yoles E, et al. Potential treatment modalities for glaucomatous neuropathy: neuroprotection and neuroregeneration. J Glaucoma 1996;5(6):427432

　　2 Ulshafer RJ, Sherry DM, Dawson R Jr, et al. Excitatory amino acid involvement in retinal degeneration. Brain Res 1990;531(12):350354

　　3 Sucher NJ, Lipton SA, Dreyer EB. Molecular basis of glutamate toxicity in retinal ganglion cells. Vision Res 1997;37(24):34833493

　　4 Hangai M, Yoshimura N, Hiroi K, et al. Imducible nitric oxide synthase in retinal ischemiareperfusion injury. Exp Eye Res 1996;63(5):501509

　　5赵桂秋，孙为荣，杨湘娟，等.急性高眼压状态视网膜自由基损伤的动物实验.中华眼科杂志 1993;29(5)：293295

　　6赵秀军.青光眼视神经损害与保护研究的最新进展.眼科 2000;9(2)：362365

　　7彭清华，罗萍，李传课，等.原发性闭角型青光眼患者血液流变学和血液中血栓素、前列腺素的改变.中国中医眼科杂志 1996;6(2)：80

　　8彭清华，罗萍，李波.青光安颗粒剂对实验性高眼压大鼠视网膜节细胞代谢作用的研究.湖南中医学院学报 1997;17(2)：5356